동시 간섭 반사 및 전체 내부 반사 형광 현미경 검사 이미징 동적 미세 소관 및 관련 단백질

1. 유동 챔버의 제조 참고: 미세유체 유동 챔버는 폴리디메틸실록산(PDMS) 마이크로채널을 세척 및 기능화된 커버 글라스에 부착하여 제작됩니다. 마이크로채널은 마스터 몰드에서 주조될 것이다. PDMS 채널의 제조 이미징되는 특정 분석에 적합한 표면 화학으로 세척 및 / 또는 기능화 된 커버 글라스를 준비하십시오.참고: 키네신 운동성 분석의 경우, 피라냐 세척 실란화 커버 글라스가 사용됩니다. 이들은 Gell et에 기재된 바와 같이 제조된다. al.1 대안으로, 더 간단한 절차는 이소프로판올에서 커버 글라스를 초음파 처리 한 다음 메탄올을 3x 20 분 사이클 동안 초음파 처리하는 것입니다. 마스터 몰드를 준비하려면 단면 고정 테이프의 스트립을 원하는 흐름 채널 크기로 자릅니다. 스트립을 10cm 페트리 접시의 바닥에 부착하고 스트립 사이에 최소 1cm 간격으로 좌우로 배치하십시오.참고: 정밀한 채널 치수가 필요한 경우, 금형은 포토리소그래피(14)를 사용하여 실리콘 웨이퍼에 제작될 수 있습니다. PDMS 중합체를 제조하기 위하여는, 경화제와 염기 엘라스토머를 1:10 질량비로 결합하십시오. 2 분 동안 혼합하십시오.참고: 이 혼합 비율은 중합체의 강성을 조정하기 위해 변화될 수 있다. 경화제에 대한 염기의 비율이 높을수록 더 부드러운 중합체가 생깁니다. 모든 기포가 사라질 때까지 진공 챔버에서 혼합물을 탈기하십시오. 혼합물을 ~ 0.5cm 두께의 층으로 마스터 몰드에 붓고 거품이 생기지 않도록주의하십시오. 혼합물을 70°C의 예열된 오븐에서 40분 동안 굽는다.참고: PDMS 블록이 두꺼운(>1cm) 경우 더 긴 경화 시간이 필요할 수 있습니다. 완전히 경화 될 때까지 5 분 단위로 가열을 계속하십시오. 중합체의 구조화된 영역을 잘라낸다. PDMS 펀처를 사용하여 채널의 각 끝에 구멍을 펀치합니다.참고: 이 프로토콜에서 구멍 직경은 0.75mm로 설정되며 필요한 유량에 따라 조정할 수 있습니다. PDMS 채널은 건조한 환경에 장기간 보관할 수 있지만 사용하기 전에 청소해야 합니다. PDMS 블록의 구조화된 측면을 청소합니다. 고정 테이프를 사용하여 큰 입자를 제거하십시오. 이소프로판올로 헹구고 메탄올로 헹구십시오. 이 헹굼을 3 배 반복하고, 초순수로 헹구고, 표면을 불어 말리십시오. 플라즈마는 산소 또는 공기 플라즈마를 사용하여 PDMS를 청소합니다.참고: 이 프로토콜에서는 18W 공기 플라즈마가 사용됩니다. 플라즈마 세척된 PDMS를 적절하게 세척된 커버 글라스 위에 놓고 80°C에서 15분 동안 핫플레이트 상에 가열한다.참고: 에폭시 수지는 PDMS 블록의 측면에 적용하여 커버 글라스에 더 잘 부착할 수 있습니다. 적절한 크기의 저밀도 폴리에틸렌(LDPE) 튜브를 구멍에 삽입합니다. 출구 튜빙을 0.5 mL 주사기에 연결하십시오.참고: 이 프로토콜에서 내경이 0.023in인 튜브는 외경 금속 어댑터의 0.025를 통해 PDMS에 연결됩니다. 유입 튜브를 용액에 침지하고 주사기로 필요한 부피를 인출함으로써 용액을 마이크로채널 내로 유동시킨다. 2. 광학 설정 현미경의 변형(그림 1) IRM 이미징13을 사용하도록 TIRF 현미경을 수정합니다. 현미경의 필터 휠에 사용되는 50/50(반사율(R)/투과(T)) 빔 스플리터를 10/90(R/T) 빔 스플리터로 교체합니다. 카메라와 현미경 사이에 이미지 분할기를 삽입합니다. 이미지 스플리터의 필터 큐브에 10/90(R/T) 빔 스플리터를 삽입합니다. 반사 빔의 전면에 600 nm 장투과 필터를 배치하고 투과된 빔 앞에 적절한 형광 방출 필터를 배치한다.참고: R/T 비율이 다른 빔 스플리터를 사용하여 수집되는 IRM 및 TIRF 방출광의 분율을 조정할 수 있습니다. 제조업체의 사양에 따라 이미지 스플리터를 정렬하여 카메라 칩의 TIRF 및 IRM 신호를 공간적으로 분리합니다.참고: 일반적인 형광단의 TIRF 신호가 미세소관의 IRM 신호보다 훨씬 약하고 두 신호가 오버레이된 경우 감지할 수 없기 때문에 신호의 공간적 분리가 필요합니다. 3. 이미징 동적 미세 소관 및 단일 키네신 분자 표면 기능화 및 패시베이션 BRB80 완충액 (80 mM Na-PIPES, 1 mM EGTA, 1 mMMgCl2, NaOH로 pH 7.8로 적정)을 반응 챔버 내로 유동시켰다. BRB80에서 0.025 mg/mL로 희석된 항생제 용액을 유동시키고 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다. BRB80으로 채널을 세척하십시오. F-127 용액 (하룻밤 사이에 BRB80에 용해된 1% 플루로닉 F-127 (w/v))을 유동시키고, 표면 패시베이션을 위해 적어도 20분 동안 인큐베이션한다.참고: 실란화된 커버 글라스 대신 쉽게 청소할 수 있는 커버 글라스를 사용하는 경우, BRB80에서 2mg/mL 카제인을 실온에서 >20분 동안 사용하여 패시베이트합니다. BRB80으로 채널을 세척하십시오. 이미징 준비 온도 제어가 필요한 경우 대물 히터를 사용하여 올바른 온도로 설정하십시오.참고: 이 프로토콜에서는 모든 실험이 28°C에서 수행됩니다. 샘플을 현미경 스테이지에 놓고 IRM 이미징을 위해 에피조명 광원(>600nm)을 켭니다.참고: 이 프로토콜에서는 백색 LED 광원이 600nm 장역 필터와 함께 사용됩니다. 현미경을 시료 표면에 집중시킵니다. PDMS-솔루션 인터페이스 근처에서 올바른 초점면을 찾습니다.참고: IRM에서 채널의 수성 내부는 PDMS 폴리머보다 훨씬 밝게 나타나야 합니다. 채널 중심 근처의 시야를 선택합니다. BRB80에 0.1 μm 형광 마이크로비드의 용액을 준비한다(밀도: 109 비드/mL, 이 프로토콜에 사용된 비드에 대한 200배 희석에 해당). 마이크로비드 용액의 적어도 하나의 채널 부피로 유동한다. IRM을 통해 반응을 모니터링합니다. 마이크로 비드가 점차적으로 표면에 “착륙”할 때까지 기다리십시오. 마이크로비드의 원하는 밀도가 달성되면, 과량의 BRB80을 세척한다. 성장 비오티닐화 구아닐 5′-α,β-메틸렌디포스포네이트 (GMPCPP)-안정화된 미세소관 종자 0.6 mL 원심분리 튜브에서, BRB80 중의 1 mM GMPCPP, 1 mMMgCl2, 및 2 μM 비오티닐화 튜불린(5-10% 표지 화학량론)을 함유하는 용액 50 μL를 제조하였다.참고 : 올바른 라벨링 화학량론은 고밀도 비오티닐화 튜불린과 라벨링되지 않은 소 튜불린을 올바른 비율로 결합하여 달성 할 수 있습니다. 용액을 얼음 상에서 5분 동안 인큐베이션한 다음, 37°C에서 12.5분 동안 인큐베이션한다.참고 : 종자의 길이는 중합 시간을 조정하여 제어 할 수 있습니다. 100 μL의 실온 BRB80을 첨가하여 중합을 중단시킨다. 용액을 실온에서 초원심분리기에서 회전시킨다(126,000 x g, 5분). 상층액을 피펫을 이용하여 폐기하여 중합되지 않은 튜불린을 제거한다.참고: 이 프로토콜에서는 공기 구동 초원심분리기가 사용됩니다. 200 μL의 실온 BRB80을 펠렛에 첨가한다. 부드럽게 그러나 철저하게 피펫팅하여 펠렛을 재현탁하십시오. 절단 팁이있는 200 μL 피펫을 사용하여 미세 소관의 전단을 줄입니다. 성장 동적 구아노신 디포스페이트 (GDP) – 튜불린 “확장”참고 : 씨앗은 유동 채널의 항생제 표면에 고정됩니다. 동적 GTP / GDP “확장”은 고정 된 씨앗의 끝에서 자랄 것입니다. BRB80에 씨앗을 20x로 희석하십시오. 희석된 종자를 반응 챔버 내로 유동시킨다. IRM을 통해 반응을 모니터링합니다. 씨앗이 점차적으로 표면에 “착륙”하고 그것에 결합 될 때까지 기다리십시오. 원하는 종자 밀도가 달성되면 BRB80으로 과잉을 씻어 내십시오. 미세소관 연장 혼합물을 제조하였다: BRB80 완충액 중의 12 μM 비표지된 튜불린, 1 mM GTP, 5 mM 디티오트레이톨 (DTT). 연장 혼합물의 적어도 하나의 채널 부피로 유동한다. 반응 온도가 28°C인지 확인하십시오. 미세 소관 확장이 시간이 지남에 따라 씨앗에서 자랄 때까지 기다리십시오.참고: 정상 상태 길이는 일반적으로 20분 이내에 달성됩니다. 이미징을 위해 동적 미세 소관을 사용하십시오. 키네신-1에 대한 단계 3.5에 기재된 바와 같이 미세소관 상의 형광 MAP를 추가하고 시각화한다.참고: 미세소관은 표면 결합되어 있기 때문에 TIRF에서 쉽게 볼 수 있습니다. 키네신 운동성 분석참고: 이 단계는 축소된 미세소관에 대한 모타일 녹색 형광 단백질(GFP) 표지된 키네신-1을 시각화하기 위한 프로토콜을 설명합니다. eGFP (rKin430-eGFP)에 융합된 절단된 래트 키네신-1 구축물을 앞서15,16에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 운동성 완충액을 준비하십시오 : BRB80에서 1 mM ATP 및 0.2 mg / mL 카제인. 키네신-eGFP를 운동성 완충액으로 10 nM로 희석한다. 2 mM ATP로 보충된 산화적 광표백(80 mM 글루코스, 80 mg/mL 글루코스 옥시다제, 32 mg/mL 카탈라아제, 0.2 mg/mL 카제인, 20 mM DTT)을 상쇄하기 위해 2x 산소 스캐빈저 용액을 준비하십시오. 0.5 nM의 최종 키네신 농도를 위해 산소 제거제 10부, BRB80 9부, 및 10 nM 키네신-eGFP의 1부를 결합한다.참고: 총 볼륨은 채널 볼륨보다 1.5배 이상 커야 합니다. 현미경 소프트웨어에서 이미징 설정을 설정합니다.참고: 이 프로토콜에서 비디오는 100ms 노출 시간으로 10fps로 녹화됩니다. 레이저 강도는 ~ 0.05kW /cm2입니다. 이미징을 시작하고 키네신 용액을 챔버로 흐르게하십시오. 측정이 완료되면 스테이지가 원형 또는 횡방향 동작으로 천천히 변환되는 짧은(~5초) 비디오를 녹화합니다. 이 비디오의 중앙값 투영을 배경 이미지로 사용하고 원시 측정에서 뺍니다. 4. 이미지 처리 및 분석 참고: 이미지 처리는 NIH ImageJ2 (imagej.nih.gov/ij/)를 사용하여 수행되었다. TIRF 및 IRM 채널의 분할 및 정렬을 자동화하기 위해 매크로가 개발되었습니다. 이 매크로를 사용하려면 GaussFit_OnSpot 플러그인을 설치해야 합니다(ImageJ 플러그인 리포지토리에서 사용 가능). 배경 녹화에서 이미지 |을 클릭하여 ImageJ에서 중간 투영을 만듭니다 . 스택 | Z 프로젝트. | 처리를 클릭하여 원시 이미지 데이터에서 중앙값 배경 투영을 빼십시오 . 이미지 계산기.참고: “32비트(부동 소수점) 결과” 옵션을 확인하십시오. 이미지 등록을 위해 관심 있는 미세소관 근처에 있는 마이크로비드 컬렉션을 선택하고 이를 사용하여 TIRF 및 IRM 이미지를 정렬합니다. 이 컬렉션의 각 비드에 대해 다중 점 선택 도구를 사용하여 TIRF 채널의 대략적인 위치를 표시한 다음 IRM 채널에서 해당 위치를 표시합니다.참고: 예를 들어, 두 개의 비드(1과 2)가 있는 경우 멀티포인트 선택은 다음과 같은 순서로 4개의 점을 갖습니다. (1) TIRF에서 비드 1, (2) IRM에서 비드 1, (3) TIRF의 비드 2, IRM의 비드 2. 제공된 ImageJ 매크로(ImageSplitterRegistration.ijm)를 실행합니다.참고: 이것은 다음 단계를 자동화한다: i) 가우시안에 피팅하여 각 비드의 중심 위치를 추정하는 단계; ii) 각각의 비드에 대해, IRM 채널 내의 중심으로부터 TIRF 채널 내의 중심을 분리하는 변위 벡터를 계산하는 단계; iii) 모든 비드에 걸쳐이 변위 벡터를 평균화하는 단계; iv) TIRF 및 IRM 채널을 별도의 이미지로 분할하는 단계; v) iii)에서 계산된 평균 변위 벡터에 의해 TIRF 이미지를 번역하는 단계; vi) TIRF 및 IRM 이미지를 다중 채널 .tiff 파일에 오버레이합니다.