動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

1. フローチャンバーの準備 注:マイクロ流体フローチャンバは、ポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロチャネルを洗浄および機能化されたカバーガラスに接着することによって構築されます。マイクロチャンネルはマスターモールドに鋳造されます。 PDMSチャネルの準備 洗浄および/または官能化されたカバーガラスを、画像化される特定のアッセイに適した表面化学で準備します。注:キネシン運動性アッセイには、ピラニア洗浄シラン処理カバーガラスが使用されます。これらは、Gell et に記載されているように調製されます。al.1 あるいは、より簡単な手順は、カバーガラスをイソプロパノールで超音波処理し、続いてメタノールを3x 20分サイクルで超音波処理することです。 マスターモールドを作製するには、片面固定テープのストリップを所望の流路サイズに切断する。ストリップを10cmのペトリ皿の底に接着し、ストリップ間に少なくとも1cmの間隔を空けて左右に配置する。注:正確なチャネル寸法が必要な場合は、フォトリソグラフィー14を使用してシリコンウェーハ上にモールドを作製することができる。 PDMSポリマーを調製するために、硬化剤とベースエラストマーとを1:10の質量比で組み合わせる。2分間混ぜる。注:この混合比は、ポリマーの剛性を調整するために変更することができます。硬化剤に対する主剤の比率が高いほど、ポリマーが柔らかくなります。 すべての気泡が消えるまで真空チャンバ内の混合物を脱気する。 混合物を厚さ約0.5cmの層でマスターモールドに注ぎ、気泡が発生しないように注意してください。 混合物を70°Cの予熱したオーブンで40分間焼成する。メモ: PDMS ブロックの厚さが厚い場合は、硬化時間が長くなることがあります (>1 cm)。完全に硬化するまで5分刻みで加熱を続けます。 ポリマーの構造領域を切り出す。PDMSパンチャーを使用してチャネルの両端にパンチ穴を開ける。メモ: このプロトコルでは、穴の直径は 0.75 mm に設定され、必要な流量に応じて調整できます。PDMSチャネルは、乾燥した環境に長期間保管することができますが、使用前に清掃する必要があります。 PDMS ブロックの構造化された側をクリーニングします。固定テープを使用して大きな粒子を除去します。イソプロパノールで洗い流し、次にメタノールですすいでください。これらのすすぎを3回繰り返し、超純水ですすぎ、表面をブロードライします。 プラズマは、酸素または空気プラズマを使用してPDMSを洗浄します。メモ: このプロトコルでは、18 W エアプラズマが使用されます。 プラズマ洗浄したPDMSを、適切に洗浄したカバーガラスの上に置き、80°Cのホットプレート上で15分間加熱する。メモ:エポキシ樹脂をPDMSブロックの側面に適用して、カバーガラスに接着することができます。 適切なサイズの低密度ポリエチレン(LDPE)チューブを穴に挿入します。アウトレットチューブを0.5 mLシリンジに接続します。メモ: このプロトコルでは、内径 0.023 インチのチューブは、外径 0.025 インチの金属アダプターを介して PDMS に接続されます。 入口チューブを溶液に浸し、シリンジで必要な体積を描画することによって、溶液をマイクロチャネルに流す。 2. 光学セットアップ 顕微鏡の変形例(図1) TIRF 顕微鏡を変更して、IRM イメージング13 を有効にします。顕微鏡のフィルターホイールに使用されている50/50(反射率(R)/透過(T))ビームスプリッタを10/90(R/T)ビームスプリッタに置き換えます。 カメラと顕微鏡の間に画像スプリッターを挿入します。 画像スプリッタのフィルタキューブに、10/90(R/T)ビームスプリッタを挿入します。反射ビームの前に600nmのロングパスフィルタを配置し、透過ビームの前に適切な蛍光発光フィルタを配置する。メモ: 異なる R/T 比のビームスプリッタを使用して、収集される IRM および TIRF 発光光の分数を調整できます。 製造元の仕様に従ってイメージスプリッタを合わせて、カメラチップ上のTIRF信号とIRM信号を空間的に分離します。注: 一般的な蛍光色素分子の TIRF シグナルは微小管の IRM シグナルよりもはるかに弱く、2 つのシグナルがオーバーレイされている場合は検出できないため、シグナルの空間的分離が必要です。 3. 動的微小管と単一キネシン分子のイメージング 表面機能化とパッシベーション BRB80緩衝液(80 mM Na-PIPES、1 mM EGTA、1 mM MgCl2、NaOHでpH 7.8に滴定)を反応チャンバに流す。 BRB80で0.025mg/mLに希釈した抗生物質溶液を流し、室温で10分間インキュベートする。 BRB80でチャンネルを洗ってください。 F-127溶液(BRB80に一晩溶解した1%プルロニックF-127(w/v))を流し、表面不動態化のために少なくとも20分間インキュベートする。メモ: シラン処理されたカバーガラスの代わりに清掃が容易なカバーガラスを使用する場合は、BRB80 に 2 mg/mL のカゼインを使用して室温で >20 分間不動態化してください。 BRB80でチャンネルを洗ってください。 イメージングの準備 温度制御が必要な場合は、対物ヒーターを使用して正しい温度に設定してください。注:このプロトコルでは、すべての実験は28°Cで行われます。 サンプルを顕微鏡ステージに置き、IRMイメージング用の落射光源(>600nm)をオンにします。メモ: このプロトコルでは、白色 LED 光源を 600 nm ロングパスフィルタとともに使用します。 顕微鏡を試料表面に焦点を合わせます。PDMS ソリューション インターフェイスの近くで正しいフォーカル プレーンを探します。注: IRM では、チャネルの水性内部は PDMS ポリマーよりもはるかに明るく見えるはずです。 チャネルの中心付近の視野を選択します。 BRB80中の蛍光マイクロビーズ0.1 μmの溶液を調製する(密度:109ビーズ/mL、このプロトコルで使用されるビーズの200倍希釈に相当)。 マイクロビーズ溶液の少なくとも1つの流路体積に流れる。 IRM を介して反応を監視します。マイクロビーズが徐々に表面に「着地」するのを待ちます。マイクロビーズの所望の密度が達成されたら、過剰分をBRB80で洗い流す。 ビオチン化グアニリル5′-α,β-メチレンジホスホネート(GMPCPP)安定化微小管種子の増殖 0.6 mL 遠沈管で、BRB80 で 1 mM GMPCPP、1 mM MgCl 2、および2 μM ビオチン化チューブリン (5 ~ 10% 標識化学量論) を含む溶液 50 μL を調製します。注:正しい標識化学量論は、高密度ビオチン化チューブリンと標識されていないウシチューブリンを正しい比率で組み合わせることによって達成することができる。 溶液を氷上で5分間インキュベートし、次いで37°Cで12.5分間インキュベートする。注:種子の長さは、重合時間を調整することによって制御することができる。 室温のBRB80を100 μL加えて重合を停止した。 室温(126,000 x g、5分)の超遠心機で溶液をスピンダウンします。ピペットを用いて上清を捨て、未重合のチューブリンを除去した。メモ: このプロトコルでは、空気駆動の超遠心分離機が使用されます。 ペレットに室温BRB80を200 μL加える。ペレットを穏やかに、しかし徹底的にピペッティングして再懸濁する。切断チップ付きの200 μLピペットを使用して、微小管のせん断を軽減します。 成長ダイナミックグアノシン二リン酸(GDP)-チューブリン「拡張」注:種子は流路の抗生物質表面に固定化されます。ダイナミックなGTP/GDPの「拡張」は、固定化された種子の端から成長します。 種子をBRB80で20倍に希釈する。希釈した種子を反応チャンバに流す。 IRM を介して反応を監視します。種子が徐々に表面に「着地」し、それに結合するのを待ちます。種子の所望の密度が達成されたら、過剰分をBRB80で洗い流す。 微小管延長混合物を調製する:BRB80緩衝液中の12μM非標識チューブリン、1mM GTP、5mMジチオスレイトール(DTT)。 伸長混合物の少なくとも1つの流路体積に流れる。反応温度が28°Cであることを確認する。 微小管の延長が時間の経過とともに種子から成長するのを待ちます。メモ: 定常状態の長さは、通常 20 分未満で達成されます。 イメージングには動的微小管を使用します。キネシン-1のステップ3.5で説明したように、微小管に蛍光MAPを追加して視覚化します。注: 微小管は表面結合しているため、TIRF で簡単に見ることができます。 キネシン運動性アッセイ注:このステップでは、収縮する微小管上の運動性緑色蛍光タンパク質(GFP)標識キネシン-1を視覚化するためのプロトコルについて説明します。eGFP(rKin430-eGFP)に融合したトランケートラットキネシン−1構築物を、先に記載したように発現および精製した15、16。 運動性緩衝液を調製する:BRB80中の1mM ATPおよび0.2mg/mLカゼイン。 運動性緩衝液中のキネシン-eGFPを10nMに希釈する。 酸化的フォトブリーチング(80 mM グルコース、80 mg/mL グルコースオキシダーゼ、32 mg/mL カタラーゼ、0.2 mg/mL カゼイン、20 mM DTT)に対抗するために 2 mM ATP を添加した 2x 脱酸素剤溶液を調製します。 脱酸素剤10部、BRB809部、および10nMキネシン-eGFP1部を組み合わせて、最終キネシン濃度を0.5nMにする。メモ: 合計ボリュームは、チャンネルボリュームの 1.5 倍以上にする必要があります。 顕微鏡ソフトウェアでイメージング設定を行います。メモ: このプロトコルでは、ビデオは 100 ミリ秒の露光時間で 10 fps で録画されます。レーザー強度は〜0.05キロワット/cm2です。 イメージングを開始し、キネシン溶液をチャンバーに流します。 測定が完了したら、ステージが円形または横方向の動きでゆっくりと平行移動する短い(〜5秒)ビデオを録画します。このビデオの中央投影を背景画像として使用し、生の測定値から減算します。 4. 画像処理・解析 注:画像処理はNIH ImageJ2(imagej.nih.gov/ij/)を用いて行った。TIRF チャネルと IRM チャネルの分割とアライメントを自動化するためにマクロが開発されました。このマクロを使用するには、GaussFit_OnSpotプラグインがインストールされている必要があります (ImageJ プラグインリポジトリで利用可能)。 背景記録から、画像|をクリックしてImageJで中央値投影を作成します。 スタック|Z プロジェクト。 [プロセス]をクリックして、生の画像データから背景投影の中央値を減 算|画像計算機。メモ: 「32 ビット (浮動小数点数) 結果」オプションを必ずチェックしてください。 画像登録のために、目的の微小管の近くにあるマイクロビーズのコレクションを選択し、それらを使用してTIRFおよびIRM画像を整列させます。 このコレクション内の各ビーズについて、 マルチポイント 選択ツールを使用して、TIRF チャンネル内のおおよその位置をマークし、次に IRM チャンネル内の対応する位置をマークします。メモ: たとえば、2 つのビーズ (1 と 2) がある場合、マルチポイント選択では、(1) TIRF のビーズ 1、(2) IRM のビーズ 1、(3) TIRF のビーズ 2、(IRM のビーズ 2) の順に 4 つのポイントが作成されます。 提供された ImageJ マクロ (ImageSplitterRegistration.ijm) を実行します。注:これにより、次の手順が自動化されます:i)ガウスにフィッティングすることによって各ビーズの中心位置を推定します。ii)各ビーズについて、前記TIRFチャネルにおける中心を前記IRMチャネルにおける中心から分離する変位ベクトルを計算するステップと、 Aiii)すべてのビーズにわたってこの変位ベクトルを平均化する工程と、iv) TIRF チャンネルと IRM チャンネルを別々の画像に分割する。v)iiiで計算された平均変位ベクトルによってTIRF画像を平行移動させる工程と、vi) マルチチャンネル.tiffファイル内の TIRF イメージと IRM イメージをオーバーレイします。