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Summary
Abstract
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Immunologie und Infektion

Tratamiento antirretroviral combinado oral en ratones humanizados infectados con VIH-1

Published: October 06, 2022
doi:
10.3791/63696
, , , , , ,
1Division of Hematology and Oncology, David Geffen School of Medicine,University of California, Los Angeles

Summary

Este protocolo describe un método novedoso para administrar medicamentos antirretrovirales combinados orales que suprimen con éxito la replicación del ARN del VIH-1 en ratones humanizados.

Abstract

La pandemia del virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1) continúa propagándose sin cesar en todo el mundo, y actualmente no hay ninguna vacuna disponible contra el VIH. Aunque la terapia antirretroviral combinada (cART) ha tenido éxito en la supresión de la replicación viral, no puede erradicar completamente el reservorio de individuos infectados por el VIH. Una estrategia de curación segura y eficaz para la infección por VIH requerirá métodos múltiples y, por lo tanto, los avances de los modelos animales para la infección por VIH-1 son fundamentales para el desarrollo de la investigación de la cura del VIH. Los ratones humanizados recapitulan las características clave de la infección por VIH-1. El modelo de ratón humanizado puede ser infectado por VIH-1 y la replicación viral puede controlarse con regímenes de cART. Además, la interrupción del cART resulta en un rápido rebote viral en ratones humanizados. Sin embargo, la administración de cART al animal puede ser ineficaz, difícil o tóxica, y muchos regímenes de cART clínicamente relevantes no pueden utilizarse de manera óptima. Además de ser potencialmente inseguro para los investigadores, la administración de cART mediante un procedimiento de inyección diaria intensiva comúnmente utilizado induce estrés por la restricción física del animal. El nuevo método oral de cART para tratar ratones humanizados infectados con VIH-1 descrito en este artículo resultó en la supresión de la viremia por debajo del nivel de detección, una mayor tasa de restauración de CD4 + y una mejor salud general en ratones humanizados infectados con VIH-1.

Introduction

La esperanza de vida de los individuos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana crónica (VIH) ha mejorado significativamente con el tratamiento antirretroviral combinado (TARV)1,2. El cART reduce con éxito la replicación del VIH-1 y aumenta el recuento de células T CD4+ a la normalidad en la mayoría de los participantes infectados crónicamente por VIH-13, lo que resulta en una mejor salud general y una reducción drástica de la progresión de la enfermedad4. Sin embargo, el reservorio latente del VIH-1 se establece incluso cuando el TAR se inicia durante la infección aguda 5,6,7. Los reservorios persisten durante años durante el TAR y el rápido rebote viral después de la interrupción del TAR está bien documentado 8,9. Las personas que viven con VIH en tratamiento antirretroviral también están predispuestas a un mayor riesgo de comorbilidades como enfermedades cardiovasculares, cáncer y trastornos neurológicos10,11,12. Por lo tanto, se necesita una cura funcional para el VIH. Los modelos animales para la infección por VIH-1 ofrecen ventajas obvias en el desarrollo y validación de nuevas estrategias de curación del VIH13,14,15. Los ratones humanizados, como modelo animal pequeño, pueden proporcionar la reconstitución de células inmunes humanas multilinaje en diferentes tejidos, lo que permite el estudio detallado de la infección por VIH16,17,18,19. Entre los modelos humanizados, el modelo humanizado de médula ósea-hígado-timo (BLT) recapitula con éxito la infección crónica por VIH-1, así como las respuestas inmunes humanas funcionales a la infección por VIH-1 20,21,22,23,24. Por lo tanto, el modelo de ratón BLT humanizado se ha utilizado ampliamente para investigar diversos aspectos en el campo de la investigación del VIH. Los ratones BLT humanizados no solo son modelos bien establecidos para la recapitulación de la infección persistente por VIH-1 y la patogénesis, sino también herramientas consecuentes para la evaluación de estrategias de intervención basadas en la terapia celular. Los autores actuales y otros han demostrado que el modelo humanizado de ratones BLT recapitula la infección persistente por VIH-1 y la patogénesis 25,26,27 y proporciona herramientas para evaluar las estrategias de intervención basadas en la terapia celular 28,29,30,31,32,33.

Los regímenes de cART que consisten en combinaciones de medicamentos antirretrovirales que se toman diariamente suprimen la replicación del VIH-1 hasta el punto de que la carga viral en individuos tratados con éxito permanece indetectable a largo plazo34. Los resultados del tratamiento de ratones humanizados infectados por el VIH con regímenes de TAR clínicamente relevantes se asemejan a los observados en individuos tratados con TAR infectados por VIH-122: los niveles de VIH-1 se suprimen por debajo de los límites de detección y la interrupción de los resultados de cART en un rebote de la replicación del VIH desde el reservorio latente35. La inyección subcutánea (SC)27,36,37 o intraperitoneal (IP)37,38,39 es la vía comúnmente utilizada para el tratamiento del TAR cART en ratones humanizados. Sin embargo, la inyección diaria intensiva induce estrés a los animales por restricción física40. También requiere mucha mano de obra y es potencialmente inseguro para los investigadores debido a una mayor exposición al VIH mientras se usan objetos punzantes. La administración oral es ideal para imitar la absorción, distribución y excreción de los fármacos antirretrovirales que toman las personas infectadas por el VIH-1. La administración oral generalmente implica procedimientos personalizados y a menudo laboriosos para poner los medicamentos antirretrovirales en alimentos esterilizados (necesarios debido a la inmunodeficiencia de los ratones) 24,37,41 o agua 42,43,44,45,46 , que puede o no ser químicamente compatible con muchos medicamentos antirretrovirales, o resultar en algo que los ratones no comerían o beberían fácilmente (lo que afectaría la dosis y los niveles de medicamentos en el cuerpo). El novedoso método de administración de cART peroral propuesto aquí supera los intentos de administración anteriores debido a su compatibilidad con diferentes tipos de medicamentos antirretrovirales, seguridad y facilidad de preparación y administración, y reducción del estrés y la ansiedad de los animales como resultado de la inyección diaria.

Tenofovir disoproxil fumarato (TDF), Elvitegravir (ELV) y Raltegravir (RAL) son fármacos poco solubles en agua. Curiosamente, se observa una mayor biodisponibilidad de TDF con alimentos grasos, lo que sugiere que la inhibición competitiva de las lipasas por los alimentos grasos puede proporcionar cierta protección para TDF47. Por lo tanto, las tazas DietGel Boost fueron seleccionadas para reemplazar la comida regular para roedores como método de administración en función de su modesto contenido de grasa (20,3 g por 100 g) en comparación con la comida regular para roedores (10 g por 100 g) y una dieta típica alta en grasas para ratones (40-60 g por 100 g)48. El peso total de una taza es de 75 g; Por lo tanto, cada taza contendrá la cantidad de alimento y, por lo tanto, medicamento, suficiente para cinco ratones durante 3 días.

Protocol

El tejido fetal humano anónimo fue adquirido comercialmente. La investigación con animales se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por la Universidad de California, Los Ángeles y el Comité de Investigación Animal (ARC) (UCLA) de acuerdo con todas las pautas federales, estatales y locales. Específicamente, todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones y pautas para el alojamiento y cuidado de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y la Asoc…

Representative Results

Suponiendo que un ratón promedio que pesa 25 g consume 4 g de alimento por día, la dosis diaria del fármaco a través de la ingesta oral corresponde a 2,88 mg / kg TFV, 83 mg / kg FTC y 768 mg / kg RAL. Para probar si el régimen alimenticio optimizado es tóxico e influye en la salud general en comparación con la inyección diaria de cART, el peso de los ratones se controló semanalmente antes y durante el cART mediante inyección oral o subcutánea. No hubo diferencias significativas de peso antes de la administrac…

Discussion

Aquí se desarrolla un método de administración oral de cART para ratones humanizados infectados con VIH-1 mediante la combinación de tres medicamentos antirretrovirales dentro de alimentos ricos en nutrientes. En comparación con la administración por inyecciones diarias, la administración oral es más fácil de usar, limita la frecuencia de administración, reduce el manejo de animales, minimiza el estrés y mejora la seguridad55. Hasta este momento, sólo unos pocos estudios en ratones hum…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a los doctores Romas Geleziunas y Jeff Murry y a la gente de Gilead por proporcionar los medicamentos antirretrovirales utilizados en este estudio. Este trabajo fue financiado por NCI 1R01CA239261-01 (a Kitchen), NIH Grants P30AI28697 (UCLA CFAR Virology Core, Gene and Cell Therapy Core y Humanized Mouse Core), U19AI149504 (PIs: Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (a Zhen), NIAID R2120200174 (PIs: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo). Este trabajo también fue apoyado por el Instituto del SIDA de UCLA, el James B. Pendleton Charitable Trust y la Fundación de la Familia McCarthy.

Materials

60 mm petri dish Thermo Scientific Nunc 150288 For aliquoting ART food
APC anti-human CD8 Antibody Biolegend 344722 For flow cytometry
BD LSRFortessa BD biosciences For flow data collection
CD34 microbeads Miltenyi Biotec 130-046-702 For NSG-BLT mice generation
Centrifuge tubes Falcon 14-432-22 For dissolving ART
DietGel Boost ClearH2O 72-04-5022 For making ART food
Elvitegravir Gilead Gifted from Gilead
Emtricitabine Gilead Gifted from Gilead
FITC anti-human CD3 Antibody Biolegend 317306 For flow cytometry
Flowjo software FlowJo For flow cytometry data analysis
HIV-1 forward primer: 5′-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 probe: 5′-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT
TAACTG [Tamra-Q]-3′;		 IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 reverse primer: 5′-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
Human fetal tissue Advanced Bioscience Resources, Inc
Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ The Jackson Laboratory 5557 For constructing the humanized mice
Pacific Blue anti-human CD45 Biolegend 304022 For flow cytometry
PerCP anti-human CD4 Antibody Biolegend 300528 For flow cytometry
QIAamp Viral RNA Kits Qiagen  52904 For measuring viral load
Raltegravir Merck Gifted from Merck
Sterile cell scrapers Thermo Scientific 179693 For aliquoting ART food
TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit Applied Biosystems 4392653 For plasma viral load detection
Tenofovir disoproxil fumarate Gilead Gifted from Gilead
Trimethoprim-Sulfamethoxazole Pharmaceutical Associates NDC 0121-0854-16 For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains
200 mg Sulfamethoxazole, USP
40 mg Trimethoprim, USP
NMT 0.5% Alcohol
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Referenzen

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Mu, W., Zhen, A., Carrillo, M. A., Rezek, V., Martin, H., Lizarraga, M., Kitchen, S. Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice. J. Vis. Exp. (188), e63696, doi:10.3791/63696 (2022).
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