El agotamiento extracelular de glucosa como medida indirecta de la absorción de glucosa en células y tejidos ex vivo

La demanda para medir la absorción de glucosa aumenta junto con la necesidad crítica de abordar un aumento epidémico en una multitud de enfermedades dependientes del metabolismo de la glucosa. Los mecanismos subyacentes de las enfermedades metabólicas degenerativas, los trastornos neurológicos y cognitivos¹, las enfermedades inflamatorias² e infecciosas³, el cáncer ^4,5, así como el envejecimiento⁶, dependen del metabolismo de la glucosa para obtener energía y su almacenamiento, los procesos anabólicos, la modificación de proteínas y genes, la señalización, la regulación de genes y la síntesis y replicación de ácidos nucleicos ^7,8,9 . La diabetes mellitus (DM) está directamente relacionada con el mal funcionamiento de la regulación de la absorción de glucosa. La DM es un espectro de enfermedades crónicas como la diabetes mellitus tipo 1, -2 y -3, la diabetes gestacional, la diabetes de inicio en la madurez de los jóvenes y otros tipos de esta enfermedad inducida por factores ambientales y / o genéticos. En 2016, el primer informe mundial de la OMS sobre la diabetes demostró que el número de adultos que viven con la DM más extendida casi se ha cuadruplicado desde 1980 a 422 millones de adultos¹⁰, y este número de pacientes con DM ha aumentado exponencialmente durante las últimas décadas. Solo en 2019, una estimación de 1,5 millones de muertes fue causada directamente por DM¹⁰. Este aumento dramático se debe al aumento de la DM tipo 2 y las condiciones que la impulsan, incluido el sobrepeso y la obesidad¹⁰. La pandemia de COVID-19 reveló un aumento de dos veces en la mortalidad en pacientes con DM en comparación con la población general, lo que sugiere el papel profundo pero poco conocido del metabolismo de la glucosa en la defensa inmune³. La prevención, el diagnóstico temprano y el tratamiento de la DM, la obesidad y otras enfermedades requieren la optimización de las mediciones de la absorción de glucosa por diferentes tejidos y la identificación de los factores ambientales¹¹,^{nutricionales 12}, endocrinos 13,^{genéticos 14} y epigenéticos¹⁵ que afectan la absorción de glucosa.

En la investigación, la absorción intracelular y/o tisular de glucosa se mide comúnmente mediante glucosa marcada fluorescentemente (FD-glucosa) in vitro 16,17,18 e in vivo¹⁹. La glucosa FD se convirtió en un método preferido en comparación con los métodos más precisos que utilizan glucosa²⁰ marcada radiactivamente, análisis analítico de espectroscopia^{de masas 21}, metabolómica²², métodos de resonancia magnética nuclear²³ y tomografía por emisión de positrones/tomografía computarizada (PET/CT)^5,24. A diferencia de la absorción de glucosa FD, los métodos analíticos que requieren más material biológico pueden implicar una preparación de muestras de varios pasos, instrumentos costosos y análisis de datos complejos. Las mediciones efectivas y económicas de la absorción de glucosa FD en cultivos celulares se han utilizado en experimentos de prueba de concepto y pueden requerir la validación por otros métodos.

La base de la aplicación de DF-glucosa para los estudios de captación de glucosa es la reducción del metabolismo de la glucosa-DF en comparación con la glucosa endógena²⁵. Sin embargo, tanto la glucosa endógena como la glucosa FD se distribuyen dinámicamente entre todos los compartimentos celulares para su uso en procesos anabólicos, catabólicos y de señalización. La compartimentación y el procesamiento dependiente del tiempo²⁵ de la glucosa FD interfieren con las mediciones de fluorescencia y representan los principales factores limitantes para el uso de este ensayo en experimentos de detección de alto rendimiento, análisis cinético, cultivo celular 3D, cocultivos y experimentos de explante de tejidos. Aquí, proporcionamos datos que demuestran una alta correlación entre el agotamiento extracelular de la glucosa FD y su absorción intracelular, lo que sugiere el agotamiento extracelular de la glucosa FD como una medida sustituta para la absorción de glucosa intracelular. La medición del agotamiento extracelular de la glucosa se aplicó para validar las diferencias específicas del tejido en la absorción de glucosa en ratones tratados con insulina y un fármaco experimental¹⁸ para proporcionar una prueba de principio de este método.

El protocolo actual describe mediciones intracelulares y extracelulares (Figura 1) de la absorción de glucosa FD en células 3T3-L1. Las secciones 1-7 del protocolo explican el cultivo y el crecimiento de las células durante 48 h; inanición celular, estimulación y mediciones extracelulares basales; y mediciones posteriores a la estimulación de la FD-glucosa extracelular y mediciones intracelulares de la FD-glucosa y la proteína. La sección 8 del protocolo describe la medición ex vivo de la captación extracelular de FD-glucosa en tejidos diseccionados de ratones ob/ob en presencia y ausencia de insulina y compuesto de aminoácidos 2 (AAC2) descrita en otra parte¹⁸.