हेमोलिटिक और फॉस्फोलिपास गतिविधि की पहचान सीधे Bioassays द्वारा समुद्र Anemones से कच्चे अर्क में
Summary
यहां, हम समुद्री एनीमोन से कच्चे जहर निकालने को प्राप्त करने और इसकी हेमोलिटिक और फॉस्फोलिपेस गतिविधि का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Abstract
समुद्री एनीमोन विष संरचना में पॉलीपेप्टाइड और गैर-प्रोटीन अणु शामिल हैं। साइटोलाइटिक घटकों में नए आणविक उपकरणों को डिजाइन करने के लिए एक उच्च जैव-तकनीकी और जैव चिकित्सा क्षमता होती है। समुद्री एनीमोन विष एक्टोडर्म और उप-सेलुलर संरचनाओं से ग्रंथियों की कोशिकाओं में स्थित होता है जिन्हें नेमेटोसिस्ट कहा जाता है, जिनमें से दोनों को पूरे समुद्री एनीमोन शरीर में वितरित किया जाता है। इस विशेषता का तात्पर्य चुनौतियों से है क्योंकि कोशिकाओं और नेमेटोसिस्ट को अन्य गैर-विषैले अणुओं के साथ जहर घटकों को छोड़ने के लिए झूठ बोला जाना चाहिए। इसलिए, सबसे पहले, जहर एक कच्चे अर्क (विभिन्न और विविध अणुओं और ऊतक मलबे का मिश्रण) से प्राप्त होता है। अगला कदम विशिष्ट bioactivities के साथ पॉलीपेप्टाइड्स का पता लगाने के लिए है। यहां, हम साइटोलिसिन की उपस्थिति की पहचान करने के लिए समुद्र एनीमोन क्रूड अर्क और बायोएसे प्राप्त करने के लिए एक कुशल रणनीति का वर्णन करते हैं। पहले चरण में साइटोलिसिन को जारी करने के लिए सस्ती और सीधी तकनीकें (हलचल और फ्रीज-पिघलने वाला चक्र) शामिल हैं। हमने उच्चतम साइटोलाइटिक गतिविधि और प्रोटीन प्राप्त किया (~ 500 मिलीग्राम प्रोटीन 20 ग्राम सूखे वजन से)। इसके बाद, अर्क की पॉलीपेप्टाइड जटिलता का विश्लेषण एसडीएस-पेज जेल द्वारा किया गया था, जो 10 केडीए और 250 केडीए के बीच आणविक वजन के साथ प्रोटीन का पता लगाता है। हेमोलिटिक परख में, हमने भेड़ लाल रक्त कोशिकाओं का उपयोग किया और एचयू50 (11.1 ± 0.3 μg / mL) निर्धारित किया। इसके विपरीत, कच्चे अर्क में फॉस्फोलिसिस की उपस्थिति को एगारोज़ के साथ एक ठोस माध्यम में एक सब्सट्रेट के रूप में अंडे की जर्दी का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। कुल मिलाकर, यह अध्ययन कच्चे अर्क को तैयार करने के लिए एक कुशल और सस्ती प्रोटोकॉल का उपयोग करता है और साइटोलिसिन, बायोटेक्नोलॉजिकल और बायोमेडिकल हितों के साथ अणुओं की पहचान करने के लिए प्रतिकृति बायोएसेस लागू करता है।
Introduction
समुद्री जानवर जैविक रूप से सक्रिय यौगिकों का एक समृद्ध स्रोत हैं। हाल के दशकों में, समुद्री एनीमोन विष की संरचना ने वैज्ञानिक ध्यान आकर्षित किया है क्योंकि इसमें हेमोलिटिक, साइटोटोक्सिक, एंजाइमेटिक (फॉस्फोलिपेस, प्रोटीज, चिटिनेज) और न्यूरोटॉक्सिक गतिविधि और प्रोटियोलिटिक गतिविधि पर निरोधात्मक प्रभाव के साथ पॉलीपेप्टाइड्स की विविधता शामिलहै। इसके अलावा, ये पॉलीपेप्टाइड्स जैव-तकनीकी और चिकित्सीय उपयोग 2,3 में आणविक उपकरणों के विकास के लिए संभावित स्रोत हैं।
जहर प्राप्त करने की जटिलता, यहां तक कि अलगाव और विषाक्त पदार्थों के लक्षण वर्णन के कारण समुद्री एनीमोन जहर और इसके आणविक घटकों के बारे में कुछ रिपोर्टें हैं। रिपोर्ट में उपयोग की जाने वाली निष्कर्षण विधियों में लाइसिस और कोशिकाओं की सामग्री को खाली करना शामिल था जो जहर उत्पादन से संबंधित और असंबंधित हैं।
सभी cnidarians में एक विशेष विशेषता उत्पादन और एक ही शारीरिक क्षेत्र में केंद्रीकृत जहर की रिहाई के लिए एक प्रणाली की अनुपस्थिति है। इसके बजाय, नेमेटोसिस्ट संरचनाएं हैं जो जहर को 4,5 रखती हैं। अन्य प्रकार की कोशिकाएं, जिन्हें एपिडर्मल ग्रंथि कोशिकाएं कहा जाता है, विषाक्त पदार्थों को भी स्रावित करती हैं और समुद्र एनीमोन6 के पूरे शरीर में भी वितरित की जाती हैं।
जहर प्राप्त करने में पहली और सबसे महत्वपूर्ण चुनौती बाद की प्रक्रियाओं में पर्याप्त हेरफेर के साथ एक अर्क की पीढ़ी है, जिसमें लैबिल प्रोटीन की निष्क्रियता या गिरावट के बिना। इसके बाद, कोशिकाओं को झूठ बोलना चाहिए, और घटकों-इस मामले में, पॉलीपेप्टाइड्स को कुशलतापूर्वक और जल्दी से निकाला जाना चाहिए, अन्य सेलुलर घटकों को समाप्त करते हुए प्रोटियोलिसिस और हाइड्रोलिसिस से बचनाचाहिए।
एक समुद्री एनीमोन के कच्चे अर्क को प्राप्त करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया जाता है; कुछ में जीव का बलिदान करना शामिल है जबकि अन्य इसे जीवित रखने की अनुमति देते हैं। जीव के पूरे शरीर के उपयोग का संकेत देने वाले तरीके जहर8 से अधिकांश विषाक्त पदार्थों की रिहाई की अनुमति देते हैं, उन तरीकों की तुलना में जो जीवों को जीवित रखते हैं, जो केवल जहर के कुछ घटकों को निकालतेहैं 9। एक अर्क की तैयारी के लिए एक विशिष्ट बायोएसे के माध्यम से ब्याज के पदार्थ की उपस्थिति और शक्ति का मूल्यांकन करने की आवश्यकता होती है, जिसमें विवो या इन विट्रो विधियों द्वारा औषधीय प्रभावों का निरीक्षण करने के लिए रणनीतियां शामिलहैं।
समुद्री एनीमोन विष में साइटोलाइटिक पॉलीपेप्टाइड्स, पोर बनाने वाले विषाक्त पदार्थ (पीएफटी) 11, और फॉस्फोलिसिस12 होते हैं; ये अणु प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन, कैंसर थेरेपी में आणविक उपकरण, और नैनोपोर3 पर आधारित बायोसेंसर के अध्ययन में मॉडल हैं। समुद्री एनीमोन पीएफटी का वर्गीकरण उनके आकार या आणविक वजन के अनुसार किया जाता है, 5 केडीए से 80 केडीए तक। 20 केडीए पीएफटी, सबसे अधिक अध्ययन किया गया और एक्टिनोपॉरिन11 के रूप में जाना जाता है, एंटीकैंसर, रोगाणुरोधी और नैनोपोर-आधारित बायोसेंसर के रूप में संभावित अनुप्रयोगों के लिए आणविक उपकरणों के विकास में अपनी जैव चिकित्सा क्षमता के लिए विशेष रुचि रखता है। फॉस्फोलिसिस सहित एक और साइटोलिसिन, विशेष रूप से फॉस्फोलिपेस ए 2 (पीएलए 2) 13, एक फैटी एसिड जारी करता है और फॉस्फोलिपिड्स को हाइड्रोलाइज़ करता है, जो कोशिका झिल्ली को अस्थिर करता है। कार्रवाई के इस तंत्र के कारण, पीएलए 2 भड़काऊ बीमारियों में अध्ययन और अनुप्रयोगों के लिए एक आवश्यक मॉडल होने का वादा करता है। यह सेल झिल्ली14 में लिपिड व्यवहार के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में काम कर सकता है।
यहां, हम समुद्री एनीमोन एंथोपल्यूरा डोवी वेरिल , 1869 से कच्चे अर्क को प्राप्त करने और हेमोलिसिन और फॉस्फोलिसिस का पता लगाने के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। दोनों प्रासंगिक विषाक्त पदार्थ हैं जिनका उपयोग नए आणविक उपकरणों को डिजाइन करने के लिए टेम्पलेट के रूप में किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
विज्ञान और उद्योग के विभिन्न क्षेत्रों में अनुप्रयोगों के साथ नए यौगिकों की उच्च मांग ने जहर के अध्ययन का नेतृत्व किया है। वेनम अणुओं के एक समृद्ध स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है जो नए आणविक उपकरण उत्पन…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को Programa de Apoyo द्वारा समर्थित किया गया था एक Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), एक अनुदान संख्या IT200819 के साथ। लेखकों ने इस पांडुलिपि के अंग्रेजी व्याकरण की जांच के लिए टॉम मूसलमैन, रॉक पेपर एडिटिंग, एलएलसी को स्वीकार किया; और सामंता Jiménez (CICESE, Ensenada), और जुआन मैनुअल Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM) की तकनीकी सहायता। हम भेड़ के रक्त को प्राप्त करने के लिए डॉ ऑगस्टो सेसर लिज़ाराज़ो चपारो (CEPIPSA) को भी धन्यवाद देते हैं। हम विशेष रूप से डॉ जोस Saniger Blesa, ICAT-UNAM, वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए अपनी प्रयोगशाला में सुविधाओं के लिए धन्यवाद.
Materials
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430766 | |
| 2-Bromophenol blue | Sigma | B75808 | |
| 2-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| Acetic Acid Glacial | J.T. Baker | 9515-03 | |
| Acrylamide | Promega | V3115 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Bisacrylamide | Promega | V3143 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Sigma | A3059-100G | |
| Bradford Protein Assays | Bio-Rad | 5000006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 3894 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge tubes | Corning | CLS430829 | |
| ChemiDoc MP system | Bio-Rad | 1708280 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clear flat.bottom 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | Bio-Rad | #1610406 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610400 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| Ductless Enclosure | Labconco | Vertical | https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c |
| Gel Doc EZ | Bio Rad. | Gel Documentation System | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-4L | |
| Hemocytometer | Marienfeld | 650030 | |
| ImageJ (Software) | NIH, USA | Version 1.53c | |
| Incubator 211 | Labnet | I5211 DS | |
| Methanol | J.T. Baker | 9049-03 | |
| Mini-PROTEAN tetra cell | Bio-Rad | 1658000EDU | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3824-01 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4.H2O | J.T. Baker | 3818-05 | |
| Origin software | version 9 | To design the plot with sigmoidal adjustments | |
| Petridish | Falcon | 351007 | |
| Pipetman kit | Gilson | F167380 | |
| Precast mini gel | BioRad | 1658004 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26620 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 252433 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Sodium citrate dihydrate | JT Baker | 3646-01 | |
| Spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | G10S UV-VIS | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 77-86-1 | |
| Volt Power Supply | Hoefer | PS300B |
Referenzen
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