टीजीटी सतह विकास कारक-एकीकृत क्रॉसस्टॉक का अध्ययन करने के लिए एक अभिनव मंच है। लचीला जांच डिजाइन, आसंजन लिगैंड की विशिष्टता, और उत्तेजना स्थितियों का सटीक मॉडुलन ईजीएफआर-इंटीग्रिन इंटरप्ले के मजबूत मात्रात्मक आकलन की अनुमति देता है। परिणाम ईजीएफआर को ‘मैकेनो-ऑर्गनाइजर’ ट्यूनिंग इंटीग्रिन यांत्रिकी के रूप में उजागर करते हैं, जो फोकल आसंजन असेंबली और सेल प्रसार को प्रभावित करते हैं।
बहुकोशिकीय जीव आसंजन, प्रसार, प्रवासन और भेदभाव सहित कई कार्यों को व्यवस्थित करने के लिए आसपास के बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में झिल्ली रिसेप्टर्स और संज्ञानात्मक लिगेंड के बीच बातचीत पर भरोसा करते हैं। यांत्रिक बलों को आसंजन रिसेप्टर इंटीग्रिन के माध्यम से सेल से ईसीएम में लिगेंड तक प्रेषित किया जा सकता है। इन सेल-जनित बलों की मात्रा और स्थानिक संगठन को एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर) सहित विकास कारक रिसेप्टर्स द्वारा संशोधित किया जा सकता है। सेल यांत्रिकी में क्रॉसस्टॉक-मध्यस्थता परिवर्तनों को मापने और उन्हें फोकल आसंजन, सेलुलर आकृति विज्ञान और सिग्नलिंग से संबंधित करने के लिए वर्तमान में उपलब्ध उपकरण सीमित हैं। डीएनए-आधारित आणविक बल सेंसर जिसे तनाव गेज टीथर (टीजीटी) के रूप में जाना जाता है, को इन परिवर्तनों को मापने के लिए नियोजित किया गया है। टीजीटी जांच अंतर्निहित बल थ्रेसहोल्ड को संशोधित करने और विवर्तन-सीमित स्थानिक रिज़ॉल्यूशन पर पूरे अनुयायी सेल सतह पर पिकोनेवटन स्केल रिसेप्टर बलों की रिपोर्ट करने की उनकी क्षमता में अद्वितीय हैं। यहां उपयोग की जाने वाली टीजीटी जांच रिसेप्टर-लिगैंड बलों द्वारा डीएनए डुप्लेक्स के अपरिवर्तनीय पृथक्करण पर निर्भर करती है जो फ्लोरोसेंट सिग्नल उत्पन्न करती है। यह सेल के संचयी एकीकृत तनाव (बल इतिहास) की मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देता है। यह आलेख एकीकृत यांत्रिकी और आसंजन गठन पर ईजीएफआर के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए टीजीटी को नियोजित करने वाले प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। टीजीटी यांत्रिक संवेदन मंच की असेंबली व्यवस्थित रूप से विस्तृत है और छवि बलों, फोकल आसंजन और सेल प्रसार की प्रक्रिया को रेखांकित किया गया है। कुल मिलाकर, जांच के अंतर्निहित बल थ्रेसहोल्ड, आसंजन लिगैंड, और उत्तेजना के लिए नियोजित विकास कारक के प्रकार और एकाग्रता को संशोधित करने की क्षमता इसे एकीकृत-मध्यस्थता बलों को विनियमित करने में विविध झिल्ली रिसेप्टर्स के परस्पर क्रिया का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत मंच बनाती है।
कोशिकाओं में यांत्रिक बलों को समझने, उत्पन्न करने और प्रतिक्रिया करने की आंतरिक क्षमता होती है, जिससे सेलुलर फेनोटाइप में परिवर्तन होता है और स्थानीय माइक्रोएन्वायरमेंट 1,2 का रीमॉडेलिंग होता है। आसंजन, प्रवासन, प्रसार, भेदभाव और घाव भरने सहित सेल व्यवहार के कई पहलुओं को विनियमित करने में बल महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं 3,4. एक कोशिका और माइक्रोएन्वायरमेंट के बीच द्वि-दिशात्मक यांत्रिक विनिमय में विपथन कैंसर सहित रोगग्रस्त अवस्थाओं को जन्म दे सकताहै 5. कई झिल्ली रिसेप्टर्स सेल-मैट्रिक्स होमियोस्टेसिस को बनाए रखने में शामिल हैं; इनमें से, इंटीग्रिन और एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर) में मजबूत तालमेल 6,7 है। शास्त्रीय रूप से, इंटीग्रिन माइक्रोएन्वायरमेंट और इंट्रासेल्युलर साइटोस्केलेटन के बीच यांत्रिक लिंक स्थापित करते हैं जबकि ईजीएफआर सेल विकास, प्रसार और अस्तित्व 8,9 को नियंत्रित करता है। ईजीएफआर एक उच्च अध्ययन चिकित्सीय लक्ष्य है, जो इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग को सुविधाजनक बनाने वाले आउट-इन विनियमन पर केंद्रित है। ईजीएफआर-इंटीग्रिन क्रॉसस्टॉक को आनुवंशिक और जैव रासायनिक रूप से कैंसर10,11 सहित कई बीमारियों की प्रगति को विनियमित करने के लिए स्थापित किया गया है। जबकि अध्ययन ईजीएफआर-इंटीग्रिन इंटरप्ले के अस्तित्व का संकेत देते हैं, परिणामों को प्लाज्मा झिल्ली 7,12,13,14 से दूर सिग्नलिंग मार्गों के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। सेल यांत्रिकी पर ईजीएफआर, या अन्य विकास कारकों का प्रभाव सेलुलर बलों और सिग्नलिंग परिणामों को मापने के लिए उपकरणों की कमी के कारण काफी हद तक अस्पष्टीकृत रहता है। चुनौती इन समानांतर सिग्नलिंग प्रतिमानों के बीच संचार का अध्ययन करने और सेल यांत्रिकी में उनके विशिष्ट योगदान को मापने के लिए उपयुक्त उपकरणों की पहचान करने में निहित है।
सेल आसंजन रिसेप्टर्स द्वारा उत्पन्न बलों को मापने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं, और पाठक को इन तकनीकों15,16 की गहन समीक्षा के लिए निर्देशित किया गया है। संक्षेप में, कर्षण बल माइक्रोस्कोपी और सूक्ष्म स्तंभ सरणी का पता लगाने नैनोन्यूटन (एनएन) बलों का अनुमान लगाने के लिए एक अंतर्निहित सब्सट्रेट के विरूपण पर भरोसा करते हैं, व्यक्तिगत रिसेप्टर बलों17,18 से अधिक परिमाण का एक क्रम। एएफएम और ऑप्टिकल चिमटी सहित एकल-अणु तकनीक, एकल प्रोटीन पिकोनेवटन (पीएन) बलों के प्रति संवेदनशील हैं, लेकिन एक समय में केवल एक रिसेप्टर को मापते हैं और अच्छे (या किसी भी) स्थानिक रिज़ॉल्यूशन की पेशकश नहीं करते हैं। डीएनए आधारित आणविक तनाव जांच और तनाव गेज टीथर (टीजीटी) जांच विवर्तन-सीमित (या बेहतर) स्थानिक संकल्प के साथ पीएन बल संकल्प प्रदान करते हैं, जिससे उन्हें फाइब्रोब्लास्ट, कैंसर कोशिकाओं, प्लेटलेट्स और प्रतिरक्षा कोशिकाओं सहित विभिन्न सेल प्रकारों से एकल-कोशिका बलों19,20 का अध्ययन करने में एक अनूठी भूमिका मिलती है 21,22,23,24 . जबकि आणविक तनाव जांच में एक विस्तारयोग्य “वसंत” तत्व होता है, जो वास्तविक समय इमेजिंग के लिए आदर्श होता है, टीजीटी जांच अपरिवर्तनीय रूप से टूट जाती है, फ्लोरोसेंट “बल इतिहास” को पीछे छोड़ देती है। टीजीटी अतिरिक्त रूप से अंतर्निहित सब्सट्रेट के तनाव थ्रेसहोल्ड को संशोधित करते हैं; समान रासायनिक रचनाओं के साथ जांच की एक श्रृंखला लेकिन विभिन्न टूटना बलों, या तनाव सहिष्णुता (टीटोल), फोकल आसंजन गठन और सेल प्रसार के लिए आवश्यक न्यूनतम तनाव को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। टीजीटी जांच में दो पूरक डीएनए किस्में होती हैं, एक सतह पर लंगर डाले हुए और दूसरा सेल को एक लिगैंड पेश करता है। यदि एक रिसेप्टर लिगैंड को बांधता है और जांच के टीटोल से अधिक बल लगाता है, तो किस्में अलग हो जाएंगी। टीटोल को आदर्श परिस्थितियों में 2 एस अंतराल में 50% जांच को तोड़ने के लिए आवश्यक निरंतर बल के रूप में परिभाषित किया गया है। “टर्न-ऑन” टीजीटी जांच में, शीर्ष स्ट्रैंड पर एक क्वेंचर को नीचे स्ट्रैंड पर फ्लोरोफोर से अलग किया जा सकता है। केवल जहां टीजीटी जांच टूट गई है, संभवतः टीटोल से अधिक या बराबर बलों द्वारा, एक फ्लोरोसेंट सिग्नल उत्पन्न किया जाएगा। टीजीटी जांच को भी तय किया जा सकता है, जिससे जैविक प्रणालियों के आसान हेरफेर और कई स्थितियों के परीक्षण की अनुमति मिलती है। इन कारणों से, इस काम में टीजीटी जांच का उपयोग किया गया था।
टीजीटी जांच को यह अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया था कि सक्रिय ईजीएफआर21 द्वारा एकीकृत-निर्भर सेल आसंजन और यांत्रिक बलों को कैसे संशोधित किया जाता है। इस काम ने ईजीएफआर को ‘मैकेनो-आयोजक’ के रूप में स्थापित किया, फोकल आसंजन संगठन और तनाव पीढ़ी को ट्यून किया। इसके अतिरिक्त, यह पाया गया कि ईजीएफ उत्तेजना ने फोकल आसंजनों के वितरण और परिपक्वता और बढ़ी हुई सेल प्रसार को प्रभावित किया। इस दृष्टिकोण का उपयोग भविष्य के अध्ययनों में यह जांचने के लिए किया जा सकता है कि विकास कारक ट्यूमर प्रगति और गतिशीलता में यांत्रिक बलों को कैसे प्रभावित करते हैं। जबकि मेसेनकाइमल संक्रमण के उपकला को विनियमित करने में ईजीएफआर-इंटीग्रिन क्रॉसस्टॉक की भूमिका स्थापित की गई है, इस प्रक्रिया में यांत्रिक बलों की भूमिका अंडर-एक्सप्लोर की गईहै 10.
यहां, 56 पीएन टीजीटी जांच के संश्लेषण और विधानसभा, ग्लास कवरलिप्स पर टीजीटी सतहों की पीढ़ी, टीजीटी सतह पर कॉस -7 कोशिकाओं के आवेदन और ईजीएफ के साथ उत्तेजना, फिक्सेशन, और फालोइडिन के साथ कोशिकाओं के धुंधला होने, और एक एंटी-पैक्सिलिन एंटीबॉडी, उच्च-रिज़ॉल्यूशन कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) और प्रतिबिंब हस्तक्षेप को कवर करने वाले इन प्रयोगों के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है और छवि परिमाणीकरण। यह प्रोटोकॉल, हालांकि कॉस -7 कोशिकाओं के ईजीएफ उत्तेजना की जांच करने के लिए लिखा गया है, कई टीजीटी आधारित प्रयोगों के लिए आसानी से अनुकूलनीय है। विभिन्न लिगेंड, टीटोल, सेल प्रकार, उत्तेजना पैरामीटर, निर्धारण के बाद लेबल किए गए प्रोटीन, और मात्रात्मक विश्लेषण को आसानी से प्रतिस्थापित किया जा सकता है, जिससे यह प्रोटोकॉल मजबूत और व्यापक रूप से उपयोगी हो जाता है।
ऊपर उल्लिखित विस्तृत चरण-दर-चरण प्रक्रिया के साथ, कोई भी सेल लगाव के दौरान अनुयायी कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न सेल आकृति विज्ञान और एकीकृत तनाव को मापने के लिए टीजीटी सतहों को तैयार कर सकता है और ईजीएफ के साथ उपचार के बाद फैल सकता है। सरल प्रयोगात्मक सेटअप के साथ सीधी जांच डिजाइन और संश्लेषण और सतह की तैयारी ने ईजीएफआर और इंटीग्रिन की बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक स्थिर मंच प्रदान किया। कुल मिलाकर, परिणाम मान्य करते हैं कि ईजीएफआर का लिगैंड-निर्भर सक्रियण सेल प्रसार को बढ़ाता है, एकीकृत रिसेप्टर्स के बल-असर गुणों को ट्यून करता है, और फोकल आसंजन संगठन और परिपक्वता को बढ़ावा देता है। टीजीटी जांच का उपयोग करके प्राप्त परिणाम व्यापक परिकल्पना का समर्थन करते हैं कि ईजीएफआर जैसे विकास कारक, ‘मैकेनो-आयोजकों’ के रूप में कार्य करते हैं, एकीकृत तनाव की मात्रा और स्थानिक संगठन को बढ़ाते हैं और फोकल आसंजनों के अभिविन्यास और यांत्रिकी को विनियमित करते हैं।
टीजीटी सतह पर आवेदन करने पर, कोशिकाएं इंटीग्रिन (αVβ3) रिसेप्टर्स के रूप में भूमि, संलग्न और फैलती हैं और सीआरजीडीएफके लिगैंड से बंधती हैं। ऐसा करने में टीजीटी जांच को यांत्रिक रूप से तोड़ा जा सकता है, जिससे लिगैंड सगाई की साइट पर प्रतिदीप्ति उत्पन्न होती है। रीडआउट सतह के साथ बातचीत करने वाले सेल का संचयी “बल इतिहास” है। टीजीटी सतहों के साथ कुछ सामान्य मुद्दे हैं जो इन प्रयोगों के दौरान मौजूद हो सकते हैं। उच्च सतह पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति (चित्रा 6 ए, बी), पैची सतह उपस्थिति, तनाव संकेत उत्पन्न करने के लिए कोशिकाओं की विफलता (चित्रा 6 सी, डी), और फैलाने के लिए कोशिकाओं की विफलता (चित्रा 6 ई, एफ) टीजीटी जांच या सतह संश्लेषण के साथ तकनीकी कमियों के कारण हो सकती है। इन सामान्य समस्याओं के समाधान तालिका 1 में प्रस्तुत किए गए हैं।
टीजीटी जांच का सीधा डिजाइन सेल जीवविज्ञानियों को केवल विशिष्ट लिगेंड और उत्तेजना प्रदान करके अन्य सेल सतह रिसेप्टर्स से हस्तक्षेप के बिना अलगाव में विशिष्ट विकास कारक-एकीकृत सिग्नलिंग परिणामों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, टीजीटी जांच पीएन संवेदनशीलता पर सेल आसंजन के दौरान व्यक्तिगत इंटीग्रिन रिसेप्टर्स को रेखांकित करने वाले तनाव थ्रेसहोल्ड की जांच की अनुमति देती है। वैकल्पिक दृष्टिकोण निश्चित नमूनों में उच्च स्थानिक संकल्प के साथ व्यक्तिगत रिसेप्टर्स द्वारा लगाए गए बलों की रिपोर्ट करने में विफलरहते हैं 31. कर्षण बल माइक्रोस्कोपी केवल एनएन बलों के प्रति संवेदनशील है, व्यक्तिगत एकीकृत रिसेप्टर्स15 द्वारा लागू बलों की तुलना में अधिक परिमाण का एक क्रम, और आणविक तनाव जांच पीएन बलों को मापते हैं, लेकिन क्योंकि वे प्रतिवर्ती हैं, वे मजबूती से निर्धारण का सामना नहीं करते हैं। इन कारणों से, टीजीटी जांच विकास कारक-एकीकृत बातचीत के यांत्रिकी का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक उपकरण है।
टीजीटी जांच से जुड़ी कई तकनीकी बारीकियां हैं जिन्हें प्रयोग डिजाइन करने से पहले विचार किया जाना चाहिए। तनाव छवि समय में एक स्नैपशॉट है, जो बल इतिहास का प्रतिनिधित्व करती है और किसी भी समय बिंदु पर रिसेप्टर-लिगैंड सगाई का संकेतक नहीं है। चूंकि सिग्नल पीढ़ी जांच पृथक्करण पर निर्भर है, टीजीटी प्रतिदीप्ति रिसेप्टर-लिगैंड सगाई से सक्रिय तनाव के तहत नहीं खुली जांच से परिणाम है। इसका मतलब है कि टीजीटी सतह पर प्राप्त एकीकृत तनाव के लिए रीडआउट प्रकृति में ऐतिहासिक और संचयी है जहां टीटोल से बड़े बल थे; टीटोल से कम वर्तमान रिसेप्टर-लिगैंड बलों के स्थान19,32 की सूचना नहीं दी गई है। क्योंकि टीजीटी टूटना रिसेप्टर-लिगैंड सगाई की समाप्ति में परिणाम देता है, सेल प्रसार इंटीग्रिन-लिगैंड इंटरैक्शन के कारण होता है जो टी टोल से कम बलोंका अनुभव करता है। इसलिए उपयोगकर्ता को इंटीग्रिन-आधारित आसंजनों से जुड़े यांत्रिक परिणामों का अनुमान लगाने के लिए समय पोस्ट-चढ़ाना को परिभाषित करते समय सावधान रहना चाहिए। अंत में, टी टोल के अर्थपर विचार किया जाना चाहिए। यहां नियोजित टीजीटी जांच में 56 पीएन का टीटोल होता है, जहां टी टोल 2 एसके लिए लागू होने पर 50% जांच को तोड़ने के लिए आवश्यक निरंतर बल है। जटिल जैविक प्रणालियों पर विचार करते समय, टीजीटी संभवतः अलग-अलग समय निर्भरता के साथ एक विषम और विविध बल ग्रेडेशन का अनुभव करते हैं। यदि टीजीटी को टी टोल से बड़े बलों द्वारा तोड़ दिया जाताहै, तो प्रतिदीप्ति कुल तनाव का कम अनुमान होगा। वैकल्पिक रूप से, लंबी अवधि के लिए लागू टीटोल के नीचे बल कम समय के लिए लागू उच्च थ्रेशोल्ड बलों के समान संख्या में जांच को तोड़ सकते हैं। इन दोनों परिदृश्यों के परिणामस्वरूप एक ही प्रतिदीप्ति तीव्रता रीडआउट हो सकता है, जिससे टीजीटी जांच33,34 का उपयोग करके सटीक तनाव परिमाण या गतिशीलता को हल करना मुश्किल हो जाता है।
कुल मिलाकर, विकास कारक उत्तेजना के साथ एकीकृत तनाव का आकलन आंतरिक नियंत्रणों के साथ प्रयोगों को डिजाइन करके, अन्य मैट्रिक्स-लेपित सतहों पर प्रोफाइल फैलाने की तुलना करके, विकास कारक उत्तेजना की उपस्थिति या अनुपस्थिति में कोशिकाओं में टीजीटी प्रतिदीप्ति के समानांतर आकलन करके और विभिन्न टीटोल के साथ टीजीटी का उपयोग करके सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए। . टीजीटी इंटीग्रिन रिसेप्टर्स, फोकल आसंजन गतिशीलता और सेल प्रसार के यांत्रिकी को विनियमित करने में विकास कारक सिग्नलिंग की भूमिका की मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न टी टोल, विभिन्न लिगेंड, विभिन्न सेल प्रकार, या विभिन्न उत्तेजना स्थितियों के साथ जांच का उपयोग करके कई टीजीटी-आधारित प्रयोगों के लिए एक टेम्पलेटके रूप में किया जा सकता है। ब्याज के किसी भी प्रोटीन को निर्धारण के बाद लेबल किया जा सकता है, और किसी भी प्रकार के मात्रात्मक छवि विश्लेषण को लागू किया जा सकता है। इस प्रकार, हम कई टीजीटी प्रयोगों के लिए एक टेम्पलेट प्रस्तुत करते हैं।
टीजीटी जांच का उपयोग इंटीग्रिन का अध्ययन करने तक सीमित नहीं है, लेकिन लिगैंड को संशोधित करके विभिन्न सेल प्रकारों में सेल झिल्ली रिसेप्टर्स की एक विविध सरणी तक बढ़ाया जा सकता है। टीजीटी जांच का उपयोग विभिन्न रिसेप्टर सिग्नलिंग कैस्केड को विनियमित करने में बलों की भूमिका की जांच करने के लिए किया गया है, जिसमें भ्रूण के विकास और न्यूरोजेनेसिस35 में नॉच रिसेप्टर यांत्रिकी की यांत्रिक भूमिका की पहचान करना, बी सेल रिसेप्टर्स36 द्वारा एंटीजन की पहचान और आंतरिककरण की मध्यस्थता करने वाली ताकत, और सिग्नल ट्रांसफर 37 की ताकत और विशिष्टता को बढ़ावा देने के लिए बलों में परिवर्तन का पता लगाने के लिए टी-सेल सतह रिसेप्टर्स की यांत्रिक सबूत पढ़ने की क्षमताशामिल है। . साथ में, ये निष्कर्ष विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग्स में टीजीटी जांच की विशाल क्षमता को उजागर करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
लेखक फलदायी चर्चाओं और आलोचनाओं के लिए मैथेस प्रयोगशाला के सदस्यों को पहचानना चाहते हैं। हम एनएसएफ कैरियर 1832100 और एनआईएच आर 01 जीएम 131099 से एएलएम को वित्त पोषण स्वीकार करते हैं।
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Millipore Sigma | 440140 | Surface Preparation |
3-hydroxypicolinic acid (3-HPA) | Millipore Sigma | 56197 | Maldi-TOF-MS matrix |
Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | A38S | Diluting EGF |
Acetonitrile (HPLC) | Fisher Scientific | A998SK | Oligonucleotide Preparation |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Cell Signaling Technology | 8878S | Immunocytochemistry |
Ammonium Chloride | Fisher Scientific | A687 | Immunocytochemistry |
Anti-Paxillin antibody [Y113] | Abcam | ab32084 | Immunocytochemistry |
BD Syringes only with Luer-Lok | BD bioscience | 309657 | Surface Preparation |
Bio-Gel P-2 | Bio-Rad | 1504118 | Oligonucleotide Preparation |
Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | Surface Preparation |
Cos-7 cells | ATCC | CRL-1651 | Cell Culture, Passage numbers 11-20 |
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips | Fisher Scientific | C14784 | Surface Preparation |
c(RGDfK(PEG-PEG)), PEG=8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid | Vivitide | PCI-3696-PI | Oligonucleotide Preparation |
Cy3B NHS ester | GE Healthcare | PA63101 | Oligonucleotide Preparation |
Dimethylformamide | Millipore Sigma | PHR1553 | Oligonucleotide Preparation |
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | MT10013C | Cell Culture |
Epidermal Growth Factor human EGF | Millipore Sigma | E9644 | Cell Culture |
Ethanol, 200 proof (100%) | Fisher Scientific | 22032601 | Surface Preparation |
Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08-772E | Surface Preparation |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10-438-026 | Cell Culture |
Flurobrite DMEM | Fisher Scientific | A1896701 | Cell Culture |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21244 | Immunocytochemistry |
Goat Serum | Fisher Scientific | 16-210-064 | Immunocytochemistry |
Hank’s balanced salts (HBSS) | Fisher Scientific | 14-170-161 | Cell Culture |
Horse Serum | Fisher Scientific | 16050130 | Immunocytochemistry |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-500 | Surface Preparation |
Nanosep MF centrifugal devices | Pall laboratory | ODM02C35 | Oligonucleotide Preparation |
NHS-azide | Fisher Scientific | 88902 | Oligonucleotide Preparation |
Nitrogen Gas Cylinder | Airgas | Surface Preparation | |
No. 2 round glass coverslips – 25 mm | VWR | 48382-085 | Surface Preparation |
Parafilm M Laboratory Film | Fisher Scientific | 13-374-10 | Surface Preparation |
Paraformaldehyde 16% | Fisher Scientific | 50-980-487 | Immunocytochemistry |
PBS, 1X | Fisher Scientific | 21-030-CV | Surface Preparation/Immunocytochemistry |
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15-070-063 | Cell Culture |
PYREX Low Form Griffin Beakers | Fisher Scientific | 02-540G | Surface Preparation |
Sodium Ascorbate | Fisher Scientific | 18-606-310 | Oligonucleotide Preparation |
Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | Oligonucleotide Preparation |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | Surface Preparation |
Streptavidin | Fisher Scientific | 434301 | Surface Preparation |
Sulfo-NHS-LC-Biotin | Fisher Scientific | 21335 | Surface Preparation |
Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A300-500 | Surface Preparation |
TEAA | Fisher Scientific | NC0322726 | Oligonucleotide Preparation |
Triethylamine | Millipore Sigma | 471283 | Oligonucleotide Preparation |
Trifluoroacetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | PI28901 | Oligonucleotide Preparation |
THPTA | Fisher Scientific | NC1296293 | Oligonucleotide Preparation |
Triton X 100 Detergent Surfact Ams Solution | Fisher Scientific | 85111 | Immunocytochemistry |
Water, DNA Grade, DNASE, Protease free | Fisher Scientific | BP24701 | Oligonucleotide Preparation |
Equipment | |||
Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm | Agilent | 653950-702 | Oligonucleotide Preparation |
High-performance liquid chromatography | Agilent | 1100 | Oligonucleotide Preparation |
Low Speed Orbital Shaker | Fisher Scientific | 10-320-813 | Immunocytochemistry |
Matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS) | Voyager STR | Oligonucleotide Preparation | |
Molecular Probes Attofluor Cell Chamber | Fisher Scientific | A7816 | Surface Preparation |
Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher | Oligonucleotide Preparation | |
Nikon Eclipse Ti inverted microscope | pe Nikon | Microscopy | |
Nikon Perfect Focus System | Nikon | Microscopy | |
NIS Elements software | Nikon | Microscopy | |
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | Microscopy | |
Quad band TIRF 405/488/561/647 cube | CHROMA | Microscopy | |
RICM Cube | CHROMA | Microscopy | |
SOLA v-nIR Light Engine | Lumencor | Microscopy | |
Thermo Forma Steri Cycle 370 CO2 Incubator | Fisher Scientific | Cell Culture | |
VWR 75D Ultrasonic Cleaner | VWR | 13710 | Surface Preparation |
Data Analysis | Use | ||
Fiji (Image J) | https://imagej.net/software/fiji/downloads | Quantitative Analysis | |
Graph Pad Prism | Graph Pad | Statistical Analysis | |
Oligo name | 5'modification/ 3' modification | Sequence (5' to 3') | Use |
Alkyne-21-BHQ2 | 5' Hexynyl/ 3' BHQ_2 | GTGAAATACCGCACAGATGCG | Top strand TGT probe |
56 pN TGT | 5' Biosg/TTTTTT/iUniAmM | CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT | Bottom strand TGT probe |
12 pN TGT | 5' AmMC6/ 3' BioTEG | CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT | Bottom strand TGT probe |