Routinematige verzameling van cryo-EM-datasets met hoge resolutie met behulp van 200 KV transmissie-elektronenmicroscoop
Summary
Cryo-EM-kaarten met hoge resolutie van macromoleculen kunnen ook worden bereikt met behulp van 200 kV TEM-microscopen. Dit protocol toont de best practices voor het instellen van nauwkeurige optische uitlijningen, data-acquisitieschema’s en selectie van beeldvormingsgebieden die allemaal essentieel zijn voor het succesvol verzamelen van datasets met hoge resolutie met behulp van een 200 kV TEM.
Abstract
Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) is het afgelopen decennium vastgesteld als een routinemethode voor het bepalen van de eiwitstructuur, waarbij een steeds groter deel van de gepubliceerde structurele gegevens is ingenomen. Recente ontwikkelingen in TEM-technologie en automatisering hebben zowel de snelheid van gegevensverzameling als de kwaliteit van verkregen beelden verhoogd, terwijl tegelijkertijd het vereiste niveau van expertise voor het verkrijgen van cryo-EM-kaarten met sub-3 Å-resoluties is verminderd. Hoewel de meeste van dergelijke structuren met hoge resolutie zijn verkregen met behulp van state-of-the-art 300 kV cryo-TEM-systemen, kunnen structuren met hoge resolutie ook worden verkregen met 200 kV cryo-TEM-systemen, vooral wanneer ze zijn uitgerust met een energiefilter. Bovendien vermindert automatisering van microscoopuitlijningen en gegevensverzameling met real-time beeldkwaliteitsbeoordeling de complexiteit van het systeem en zorgt het voor optimale microscoopinstellingen, wat resulteert in een hogere opbrengst van beelden van hoge kwaliteit en de algehele doorvoer van gegevensverzameling. Dit protocol demonstreert de implementatie van recente technologische vooruitgang en automatiseringsfuncties op een 200 kV cryotransmissie-elektronenmicroscoop en laat zien hoe gegevens kunnen worden verzameld voor de reconstructie van 3D-kaarten die voldoende zijn voor de novo atomaire modelbouw. We richten ons op best practices, kritieke variabelen en veelvoorkomende problemen waarmee rekening moet worden gehouden om de routinematige verzameling van dergelijke cryo-EM-datasets met hoge resolutie mogelijk te maken. In het bijzonder worden de volgende essentiële onderwerpen in detail besproken: i) automatisering van microscoopuitlijningen, ii) selectie van geschikte gebieden voor gegevensverzameling, iii) optimale optische parameters voor hoogwaardige gegevensverzameling met hoge doorvoer, iv) energiefilterafstemming voor verliesvrije beeldvorming, en v) gegevensbeheer en kwaliteitsbeoordeling. Toepassing van de beste praktijken en verbetering van de haalbare resolutie met behulp van een energiefilter zal worden gedemonstreerd op het voorbeeld van apo-ferritine dat werd gereconstrueerd tot 1,6 Å, en Thermoplasma acidophilum 20S proteasoom gereconstrueerd tot 2,1-Å resolutie met behulp van een 200 kV TEM uitgerust met een energiefilter en een directe elektronendetector.
Introduction
Bepaling van de eiwitstructuur is van cruciaal belang voor het begrijpen van de moleculaire architectuur, functie en regulatie van eiwitcomplexen die betrokken zijn bij belangrijke cellulaire processen, zoals celmetabolisme, signaaltransductie of gastheer-pathogeeninteracties. Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) is naar voren gekomen als een krachtige techniek die in staat is om de 3D-structuur van veel eiwitten en hun complexen op te lossen die te uitdagend waren voor de traditionele structurele technieken, zoals röntgendiffractie en NMR-spectroscopie. Cryo-EM is met name bewezen als de voorkeursmethode voor membraaneiwitten, die niet gemakkelijk kunnen worden gekristalliseerd of bereid in voldoende hoeveelheden voor de traditionele structurele technieken, en heeft nieuwe inzichten opgeleverd in de structuur en functie van belangrijke cellulaire receptoren en ionkanalen 1,2,3,4,5 . Meest recent heeft cryo-EM een belangrijke rol gespeeld in de strijd tegen de Covid-19-pandemie door het mechanisme van SARS-CoV-2-infectie op moleculair niveau te bepalen, wat de oorsprong van de ziekte Covid-19 ophelderde en de basis vormde voor de snelle ontwikkeling van efficiënte vaccins en therapeutica 6,7,8,9,10.
Doorgaans worden high-end 300-kV transmissie-elektronenmicroscopen (TEM) gebruikt voor structuurbepaling met hoge resolutie van biomoleculen door cryo-EM single-particle analysis (SPA) om hun conformatie en interacties te onthullen. Onlangs bereikte de SPA-techniek een nieuwe grens toen de gemeenschappelijke benchmark cryo-EM-monster apo-ferritine werd gereconstrueerd met atomaire resolutie (1,2 Å) 11,12 met behulp van een 300 kV TEM uitgerust met het cold field emission gun (E-CFEG), een directe elektronendetector en een energiefilter. Bij deze resolutie was het mogelijk om posities van individuele atomen in de structuur, conformatie van individuele aminozuurzijketens, evenals waterstofbinding en andere interacties ondubbelzinnig op te lossen, die nieuwe mogelijkheden openen voor op structuur gebaseerde medicijnontdekking van nieuwe doelen en optimalisatie van bestaande kandidaat-geneesmiddelen.
Mid-range 200 kV TEM microscopen worden vaak gebruikt voor monsterscreening en monsteroptimalisatie voordat de uiteindelijke hoge resolutie gegevensverzameling met behulp van de high-end TEM microscopen, met name bij grotere cryo-EM-faciliteiten. Doorgaans kunnen afgebeelde monsters worden opgelost in het resolutiebereik van 3-4 Å dat voldoende is om over te stappen naar een high-end 300 kV TEM voor de uiteindelijke gegevensverzameling. Bijgevolg wordt de gegevensverzameling met behulp van de 200 kV TEM vaak niet verder geoptimaliseerd voor de hoogst mogelijke resolutieresultaten. Bovendien kunnen veel interessante biologische vragen al bij deze resoluties worden beantwoord en gepubliceerd, omdat alle aminozuurzijketens al zijn opgelost en de bezetting van ligandbindingsplaatsen ook betrouwbaar kan worden bepaald13. Het is al aangetoond dat 200-kV TEM’s resoluties kunnen bereiken van meer dan 3 Å voor tal van monsters 14,15,16,17,18. Beelden genomen bij 200 kV vertonen inherent een hoger contrast van afgebeelde deeltjes, wat zelfs een nauwkeurigere initiële uitlijning van de deeltjes kan vergemakkelijken, ondanks meer verzwakt signaal bij hoge resolutie in vergelijking met 300 kV TEM-beelden. Het is belangrijk op te merken dat de bereikte resolutie van gereconstrueerde cryo-EM-kaarten ook wordt beperkt door structurele flexibiliteit en conformatie heterogeniteit van afgebeelde monsters, die van invloed is op zowel 200-kV- als 300-kV-reconstructies. In feite werden veel meer cryo-EM-reconstructies verkregen met behulp van de 300-kV-systemen opgelost in het resolutiebereik van 3-4 Å dan bij hogere resoluties19. Omdat 200 kV TEM-microscopen minder complex zijn en in kleinere ruimtes passen, vormen deze microscopen een goede, goedkopere optie voor structuurbepaling van biologische macromoleculen door cryo-EM met behoud van automatisering van lange gegevensverzamelingen van meerdere monsters die zijn opgeslagen in het microscoop Autoloader-systeem.
Het verzamelen van cryo-EM datasets voor het bepalen van de structuur met hoge resolutie vereist een nauwkeurige uitlijning van de microscoopoptiek. Kolomuitlijningen gaan systematisch van de elektronenbron naar het condensorlenssysteem, de objectieflens en het energiefilter met een elektronendetector. De volledige volgorde van uitlijningen is meestal niet vereist. Indien nodig wordt de gebruiker begeleid via semi-geautomatiseerde procedures met een juiste beschrijving van elke stap in een contextbewust helpvenster tijdens de uitlijningsprocedure in de gebruikersinterface van de microscoop (Direct Alignments-bedieningspaneel). Zodra de microscoop volledig is uitgelijnd, blijft de elektronenoptiek stabiel en hoeven de uitlijningen gedurende ten minste een paar maanden niet te worden gewijzigd. Alleen de meest gevoelige uitlijningen, zoals parallelle verlichting van het monstervlak, objectief astigmatisme en comavrije uitlijning, moeten worden verfijnd vlak voordat met het verzamelen van elke dataset wordt begonnen. De kwaliteit van de verzamelde gegevens kan vervolgens tijdens het verzamelen van gegevens worden bewaakt met behulp van verschillende softwarepakketten, zoals EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live20, Relion21, Scipion22, WARP23 of Appion24.
Naast nauwkeurige uitlijningen van de microscoop, is de hoge kwaliteit van goed gezuiverde monsters met minimale conformatie- en compositionele heterogeniteit ook een voorwaarde voor het verzamelen van datasets met hoge resolutie en het oplossen van structuren met hoge resolutie. Meer details over typische protocollen, frequente uitdagingen en mogelijke remedies zijn te vinden in andere beoordelingen gewijd aan dit onderwerp 25,26,27. In wezen is het van cruciaal belang om gebieden op een bepaald cryo-EM-raster te vinden die voldoende dun ijs hebben om informatie met hoge resolutie te behouden, en individuele deeltjes zijn dicht verdeeld in willekeurige oriëntaties zonder overlappingen. Typische cryo-EM-roosters hebben echter een niet-uniforme ijsdikte en het is daarom belangrijk om de optimale gebieden voor beeldvorming te vinden en te selecteren. Verschillende middelen voor schatting van de ijsdikte op het rooster zijn beschikbaar in softwarepakketten voor het geautomatiseerd verzamelen van cryo-EM-datasets, zoals EPU 2, Leginon28 of SerialEM29.
De komst van snelle en gevoelige directe elektronendetectoren maakte het mogelijk om beelden in vele fracties te verzamelen als films die compensatie van door bundels geïnduceerde bewegingen mogelijk maakten en resulteerden in een aanzienlijke toename van de kwaliteit en kwantiteit van gegevens die worden gebruikt bij beeldverwerking en uiteindelijke 3D-reconstructie30. Tegelijkertijd bieden automatisering en gegevensverzameling met hoge doorvoer enorme datasets met duizenden afbeeldingen / films die uitdagingen vormen voor gegevensopslag en -toegang. Het aangenomen model met grote cryo-EM-faciliteiten die tientallen tot honderden gebruikers bedienen, vraagt vooral om georganiseerd gegevensbeheer met de juiste tracking en gegevensuitwisseling in gevestigdecryo-EM-pijplijnen 31,32.
Deze studie beschrijft een protocol voor het routinematig verzamelen van cryo-EM datasets met hoge resolutie met behulp van de 200 kV Glacios TEM microscoop. Noodzakelijke uitlijningen van de microscoopoptiek worden beschreven, samen met procedures voor de evaluatie van cryo-EM-monsters en de selectie van geschikte gebieden voor gegevensverzameling met hoge resolutie. De organisatie van verzamelde gegevens en gerelateerde metagegevens met voorbeeldinformatie wordt gedemonstreerd in Athena – een gegevensbeheerplatform dat de beoordeling van voorbeeldinformatie en verzamelde gegevens vergemakkelijkt. Met behulp van het apo-ferritinemonster van de muis was het mogelijk om een 3D-reconstructie te bereiken met een resolutie van 1,6 Å13. Met behulp van het beschreven protocol hebben we ook de 3D-dichtheidskaart van het 20S-proteasoom uit Thermoplasma acidophilum gereconstrueerd met een resolutie van 2,1 Å.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het beschreven protocol gaat ervan uit dat de optiek van de gebruikte TEM-microscoop zich in een goed uitgelijnde toestand bevindt. Voor de 200 kV TEM die in dit protocol wordt gebruikt, worden dergelijke kolomuitlijningen uitgevoerd, geverifieerd en opgeslagen door een ervaren servicetechnicus na microscoopinstallatie of een significante service-interventie. Deze uitlijningsinstellingen kunnen op elk moment worden opgeroepen in de gebruikersinterface van de microscoop. Gebruikers kunnen de direct uitlijningsprocedures in de microscoopgebruikersinterface gebruiken om kritieke parameters opnieuw aan te passen. Sommige uitlijningen, zoals kantelbaar en pistoolverschuiving, zijn stabiel en hoeven niet dagelijks door gebruikers te worden aangepast. Controles en heruitlijningen (indien nodig) van het kantelen en verschuiven van het pistool door de microscoopbegeleider worden twee keer per jaar geadviseerd. Aan de andere kant zijn sommige uitlijningen van cruciaal belang en moeten ze vóór elke gegevensverzameling worden uitgelijnd zoals beschreven in het bovenstaande protocol (zoals objectief astigmatisme en coma-vrije uitlijning). Als de Autocoma-functie in de analysesoftware niet convergeert, moet de uitlijning van de kantelpunten en/of het rotatiecentrum worden gecontroleerd en aangepast en moet de juiste centrering van het C2-diafragma worden bevestigd. Daarna moet de Autostigmate-functie worden uitgevoerd, omdat objectieve stigmatoren ook worden gebruikt voor comacorrectie. Deze uitlijningen moeten worden herhaald totdat zowel Autostigmate als Autocomafunctions slagen bij hun eerste iteratie. Indien nodig kan een ander gebied worden geselecteerd (bijv. koolstoffolie ondersteunen zonder ijs), de vervaging van afbeeldingen aangepast of de beeldacquisitietijd worden verhoogd om de signaal-ruisverhouding in verworven beelden te optimaliseren en de zichtbaarheid van meerdere Thon-ringen in de Fouriertransformatie van de verkregen beelden te optimaliseren.
Moderne cryo-EM microscopen genereren enorme hoeveelheden gegevens die vaak meer dan 1 TB per dataset bedragen om 3D-reconstructies met hoge resolutie te bereiken, met name voor eiwitten met een lage symmetrie. Cryo-EM-gegevens en -resultaten worden meestal ook aangevuld met gegevens en resultaten van orthogonale methoden om structuur-functierelaties in elk wetenschappelijk project volledig te begrijpen. Organisatie van verzamelde gegevens, hun overdracht naar een beeldverwerkingspijplijn en het delen van een resulterende cryo-EM-reconstructie onder medewerkers stellen aanvullende eisen aan nieuwe gebruikers van cryo-EM-methodologie om hun lokale IT-infrastructuur op te zetten. Gegevensbeheersoftware, zoals Athena, vergemakkelijkt gecentraliseerde opslag van gegevens die zijn verkregen door elk aangesloten instrument of software die wordt beheerd door een geregistreerde gebruiker. Opgeslagen gegevens en metagegevens zijn toegankelijk via een eenvoudige webbrowserinterface voor meerdere gebruikers, die verschillende rollen in het project kunnen hebben met verschillende toegangsrechten (als eigenaar, medewerker of kijker) op basis van hun aanmeldingsgegevens en definitie voor het delen van gegevens in de experimentinstellingen. Deze digitalisering van experimentele workflows biedt middelen voor het delen van gegevens en metadata tussen medewerkers zonder onnodige duplicatie en verhoogt de productiviteit en traceerbaarheid van gebruikte workflows. Implementatie van een algemene en aanpasbare structuur van projecten, experimenten en workflows in datamanagementsoftware is universeel en maakt aanpassing en integratie van orthogonale experimenten mogelijk met behulp van complementaire methoden in een enkele projectdatabase.
De selectie van gebieden voor de gegevensverzameling op een cryo-EM-raster is van cruciaal belang voor de succesvolle verwerving van datasets met hoge resolutie. Cryo-EM-roosters geproduceerd met traditionele dompelvriesmiddelen, zoals de Vitrobot (een volledig geautomatiseerd vitrificatiesysteem), geven doorgaans een gradiënt van ijsdikte over het rasteroppervlak weer (figuur 4). Dit kan gunstig zijn omdat het raster gebieden met verschillende ijsdiktes bevat; gebieden met de ideale ijsdikte voor gegevensverzameling moeten echter worden geïdentificeerd zoals beschreven in het bovenstaande protocol. Een optimaal cryo-EM-raster moet zo min mogelijk transferijsvervuiling bevatten en voldoende rastervierkanten bevatten met intacte gatvormige ondersteuningsfolie. Het verzamelen van gegevens over rastervierkanten met scheuren of gebroken gebieden wordt niet aanbevolen, omdat verzamelde afbeeldingen worden beïnvloed door een aanzienlijk sterkere algehele drift bij verlichting door een elektronenbundel in vergelijking met de rastervierkanten met intacte ondersteuningsfolie. Een teveel aan kristallijn ijs kan de meeste foliegaten dichten en/of de autofocus verstoren en dergelijke rastervierkanten moeten ook worden vermeden. Rastervierkanten met dun ijs vertonen meestal grote glasachtige gebieden en veel heldere foliegaten die zichtbaar zijn in een afbeelding die is gemaakt met de Atlas-preset. Het voorkomen van dikker ijs in de buurt van roosterbalken is te verwachten en kritiekloos omdat foliegaten in deze delen van het rastervierkant worden uitgesloten tijdens de gatselectieprocedure. De aanwezigheid van verschillende lege gaten in een rastervierkant kan betekenen dat glasachtig ijs in de omliggende gaten extreem dun is en beschadigde deeltjes of helemaal geen deeltjes kan bevatten. Over het algemeen is het verstandig om rastervierkanten te kiezen met een verscheidenheid aan ijsdiktes op verschillende regio’s op het raster voor initiële screening en beoordeling om te begrijpen welke gebieden de beste omstandigheden hebben voor gegevensverzameling met hoge resolutie en de ideale deeltjesdichtheid en oriëntatieverdeling vertonen. Voor de apoF- en 20S-proteasoommonsters die in deze studie worden gebruikt, bevatten gebieden met het dunste waarneembare ijs de beste omstandigheden voor beeldvorming met hoge resolutie van deze monsters.
Bij het automatisch selecteren van gaten in alle geselecteerde rastervierkanten met behulp van de software voor gegevensverzameling, wordt geadviseerd om de sjabloonuitvoeringstaak uit te voeren op een representatief gat in elk rastervierkant om te controleren en ervoor te zorgen dat er geen te dikke of te dunne of onverwacht niet-glasachtige vierkanten zijn gekozen voor gegevensverzameling. Tijdens data-acquisitie kunnen belangrijke kwaliteitsindicatoren van verzamelde beelden, zoals beelddrift en CTF-fitting, worden bewaakt met behulp van EQM. Gegevensverzameling kan vervolgens worden geoptimaliseerd door gebieden over te slaan die afbeeldingen van slechte kwaliteit opleveren. Afbeeldingen met ctf-pasvormen met een hoge resolutie kunnen echter nog steeds afbeeldingen bevatten met deeltjes in een paar voorkeursoriëntaties of deeltjes die zijn gedenatureerd in een te dunne ijslaag. Real-time deeltjesselectie en 2D-classificatie van verzamelde beelden zouden aanvullende informatie opleveren over de kwaliteit van structurele gegevens in afgebeelde deeltjes en zowel voorkeursoriëntaties van intacte deeltjes in ijs als inconsistente structuur van (gedeeltelijk) gedenatureerde deeltjes onthullen. De berekening van klassegemiddelden kan daarom helpen om geschikte regio’s voor gegevensverzameling verder te verfijnen, zoals al is geïmplementeerd en getoond in andere softwarepakketten23,28.
De selectie van de beeldvormingsinstellingen voor gegevensverzameling, zoals vergroting, elektronendosissnelheid en onscherpbereik, is afhankelijk van verschillende criteria, zoals de doelresolutie, grootte van het eiwit, monsterconcentratie, gewenste microscoopdoorvoer, enz. Voor de directe elektronendetectorcamera die in deze experimenten werd gebruikt, werd het elektronendosistempo gekozen in het bereik van 4-5 e–/pix/s door een geschikte SPOT-grootte en -intensiteit te selecteren om parallelle verlichting te behouden. Zoals weergegeven in tabel 1, kan een andere SPOT-grootte worden gebruikt in de vooraf ingestelde hole/eucentric height om te zorgen voor voldoende signaal-ruisverhouding in het beeld voor het centreren van gaten tijdens het verzamelen van gegevens. De vergroting moet zo worden gekozen dat de pixelgrootte minstens 2-3x kleiner is dan de doelresolutie voor de cryo-EM-reconstructie. De hogere vergroting (d.w.z. kleinere pixelgrootte) wordt echter gebruikt, het kleinere gezichtsveld wordt vastgelegd in afbeeldingen en er zijn minder deeltjes per afbeelding, wat uiteindelijk leidt tot een langere tijd voor het verzamelen van gegevens om afbeeldingen te verzamelen met voldoende deeltjes om 3D-kaarten te reconstrueren tot een hoge resolutie. Voor het apoF-monster gebruikten we de pixelgrootte van 0,43 Å omdat we voldoende monsterconcentratie hadden voor een hoge dichtheid van deeltjes in afbeeldingen en gericht waren op sub-2 Å-resolutie van de reconstructie. Voor het 20S proteasoommonster gebruikten we de pixelgrootte van 0,68 Å om een groter gezichtsveld in verkregen afbeeldingen te bestrijken. Typisch voor 200 kV TEM microscopen worden cryo-EM beelden verkregen in het onscherptebereik van 0,8 tot 2,0 μm. Met het verbeterde contrast en de signaal-ruisverhouding met behulp van het energiefilter kunnen gegevensacquisities echter veel dichter bij de focus worden gedaan om informatie met hoge resolutie in verkregen beelden beter te behouden als gevolg van kleinere aberraties en dienovereenkomstig verminderd verval van de CTF-envelopfunctie. We gebruiken ook geen objectief diafragma omdat het diafragma extra beeldafwijkingen kan introduceren terwijl het beeldcontrast al voldoende is verbeterd door het energiefilter te gebruiken. Voor de apoF- en 20S-proteasoommonsters gebruikten we de onscherpte-instellingen van 0,5 μm, 0,7 μm en 0,9 μm. Voor kleinere eiwitten (<200 kDa) gebruikten we onscherpte-instellingen van -0,5 μm, -0,7 μm en -0,9 μm om het contrast van deeltjes te verbeteren en gemakkelijker deeltjes te verzamelen en initiële grove uitlijning te vergemakkelijken in de 3D-verfijningsstap van 3D-reconstructie, wat leidde tot ~ 2,5 Å resolutie 3D-kaarten (ongepubliceerde resultaten).
We hebben al aangetoond dat beeldvorming met een energiefilter de signaal-ruisverhouding (SNR) verbetert in cryo-EM-beelden verzameld op de high-end 300 kV TEM microscopen11. In feite, wanneer elektronen door een monster gaan, treden twee hoofdtypen interacties op: i) Elastisch verstrooide elektronen behouden hun energie en dragen bij aan beeldvorming door interferentie met de niet-verstrooide invallende bundel via het fasecontrastmechanisme ii) inelastisch verstrooide elektronen verliezen wat energie in het monster en dragen voornamelijk bij aan ruis in beelden. Daarom kan SNR aanzienlijk worden verbeterd door de inelastisch verstrooide elektronen, die een lagere energie hebben dan de invallende bundel en elastisch verstrooide elektronen, te filteren met behulp van een smalle energiespleet. Het is echter van cruciaal belang om een voldoende stabiel energiefilter te gebruiken, zoals de Selectris of Selectris-X, om zeer smalle (10 eV of kleinere) spleten te kunnen gebruiken gedurende lange (12+ uur) geautomatiseerde gegevensverzameling van cryoEM-datasets met hoge resolutie.
Cryo-EM-beelden verkregen met 200 kV TEM microscopen onder dezelfde omstandigheden als met 300 kV TEM microscopen vertonen kleinere SNR bij hoge resolutie (met name <4 Å) als gevolg van sneller verval van de CTF-envelopfuncties. Bijgevolg is een groter aantal deeltjes (en dus een hoger aantal verzamelde beelden) vereist om een bepaalde resolutie te bereiken bij gebruik van 200 kV TEM's. Bovendien is de scherptediepte (10-25 nm in het resolutiebereik van 2-3 Å) ook ongeveer 20% kleiner in 200 kV-beelden35, wat betekent dat minder deeltjes in de ijslaag (meestal 20-50 nm dik) volledig scherp zullen zijn en constructief bijdragen aan alle hoge resolutiekenmerken van een berekende 3D-reconstructie, tenzij de onscherptewaarden voor elk deeltje onafhankelijk worden verfijnd in de latere stadia van de 3D-reconstructieprocedure. Voor grotere deeltjes (zoals icosaëdrale virionen of andere macromoleculaire assemblages) kan de deeltjesgrootte de scherptediepte bij hoge resoluties overschrijden en fasefouten introduceren als gevolg van planaire benadering van de Ewald-bol in de standaard 3D-reconstructiealgoritmen36. Deze fouten kunnen worden verfijnd door geavanceerde algoritmen die al zijn geïmplementeerd in gemeenschappelijke cryo-EM-beeldverwerkingspakketten 37,28,39. Omdat de Ewald-bol een grotere kromming heeft in 200 kV-gegevens dan 300 kV-gegevens, is de Ewald-bolcorrectie nodig bij relatief lagere resoluties en/of voor relatief kleinere macromoleculaire assemblages bij gebruik van 200 kV TEM’s. Aan de andere kant vertonen 200 kV-beelden een hoger contrast van deeltjes in dun ijs (20-50 nm) dat aanzienlijk dunner is dan het gemiddelde vrije pad van 200-300 keV-elektron (220-280 nm). Het hogere contrast helpt om de juiste globale uitlijning van individuele deeltjes te verbeteren, met name voor het zwak verstrooien van kleinere eiwitten waarvan de structuur nog niet bekend is en het 3D-referentiemodel nog niet goed is ingeburgerd.
Hier hebben we op het voorbeeld van een 20S-proteasoom aangetoond dat het beeldcontrast en de kwaliteit op dezelfde manier kunnen worden verbeterd met een energiefilter bij gebruik van een 200 kV TEM-microscoop. Met hetzelfde aantal deeltjes werden gegevens verzameld met behulp van de 20 eV-spleet gereconstrueerd tot een resolutie van 2,26 Å in vergelijking met gegevens die werden verzameld met de volledig geopende energiespleet die alleen werd gereconstrueerd tot een resolutie van 2,34 Å. De beste reconstructie werd bereikt op basis van gegevens die werden verzameld met behulp van de 10 eV-spleet die werd gereconstrueerd tot een resolutie van 2,14 Å. Deze resultaten komen overeen met de theoretische voorspelling dat filtering van de inelastisch verstrooide elektronen de SNR in verzamelde beelden verhoogt en een hogere resolutie in cryo-EM-reconstructies van het gegeven aantal deeltjes mogelijk maakt, zoals samengevat in tabel 4. Deze resultaten werden verder bevestigd door de B-factoren berekend uit deze datasets die wijzen op een hogere kwaliteit van beelden in de energie-gefilterde datasets.
We kunnen daarom concluderen dat terwijl 300 kV TEM microscopen de hoogste doorvoer en de hoogst mogelijke resolutie leveren in cryo-EM reconstructies, de 200 kV TEM microscopen ook hoogwaardige datasets bieden voor cryo-EM reconstructies met hoge resolutie. We hebben hier laten zien dat de kwaliteit van de verkregen beelden, en dus de algehele time-to-structure, verder kan worden verbeterd door gebruik te maken van de 200 kV TEM uitgerust met een energiefilter en een directe elektronendetector. Het gepresenteerde protocol beschrijft alle noodzakelijke stappen voor het routinematig verkrijgen van cryo-EM-gegevens met hoge resolutie met behulp van deze opstelling en onthult fijne structurele details van macromoleculaire 3D-structuren, die essentieel zijn voor het begrijpen van de belangrijkste structuur-functierelaties in structurele biologie en op structuur gebaseerd medicijnontwerp.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Geen.
Materials
| AutoGrid rings | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids. |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | Package of 100 clips that secure the standard EM grids inside the AutoGrid rings. |
| Data Management Platform | Thermo Fisher Scientific | 1160939 | Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software |
| EPU Quality Monitor | Thermo Fisher Scientific | 1179770 | |
| EPU Software | Thermo Fisher Scientific | 1025080 | Part of the Glacios base configuration |
| Ethane 3.5 | Westfalen | A06010110 | Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol) |
| Falcon 4 200kV | Thermo Fisher Scientific | 1166936 | Direct electron detector |
| Glacios | Thermo Fisher Scientific | 1149551 | 200 kV TEM |
| GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification | Quorum | N/A | also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602) |
| QuantiFoil grids | Quantifoil | N/A | R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid |
| Relion | MRC Laboratory of Molecular Biology | N/A | open source software: https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/ |
| Selectris with Falcon 4 for 200 kV |
Thermo Fisher Scientific | 1191753 | Energy filter |
| Selectris X with Falcon 4 for 200 kV |
Thermo Fisher Scientific | 1191755 | Energy filter |
| UltrAuFoil grids | Quantifoil | N/A | R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids |
| Vitrobot Mk. IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | Automated vitrification system |
| Whatman 595 filter paper | Thermo Fisher Scientific | AA00420S |
Referenzen
- Wang, J., Hua, T., Liu, Z. -. J. Structural features of activated GPCR signaling complexes. Current Opinions in Structural Biology. 63, 82-89 (2020).
- Chen, S., Gouaux, E. Structure and mechanism of AMPA receptor – auxiliary protein complexes. Current Opinions in Structural Biology. 54, 104-111 (2019).
- Kühlbrandt, W. Structure and mechanisms of F-Type ATP synthases. Annual Review of Biochemistry. 88, 515-549 (2019).
- Laverty, D., et al. Cryo-EM structure of the human α1β3γ2 GABA A receptor in a lipid bilayer. Nature. 565 (7740), 516-520 (2019).
- Liu, F., Zhang, Z., Csanády, L., Gadsby, D. C., Chen, J. Molecular structure of the Human CFTR ion channel. Cell. 169 (1), 85-95 (2017).
- Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
- Ke, Z., et al. Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions. Nature. 588, 498-502 (2020).
- Yan, R., Zhang, Y., Li, Y., Xia, L., Guo, Y., Zhou, Q. Structural basis for the recognition of SARS-CoV-2 by full-length human ACE2. Science. 367 (6485), 1444-1448 (2020).
- Walls, A. C., Park, Y. -. J., Tortorici, M. A., Wall, A., McGuire, A. T., Veesler, D. Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Cell. 180, 281-292 (2020).
- Chiba, S., et al. Multivalent nanoparticle-based vaccines protect hamsters against SARS-CoV-2 after a single immunization. Communications Biology. 4 (1), 597 (2021).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Bai, X. C. Seeing atoms by single-particle Cryo-EM. Trends in Biochemical Sciences. 46 (4), 253-254 (2021).
- Koh, A., et al. High-resolution cryo-EM at 200kV enabled by Selectris-X and Falcon 4. Microscience Microscopy Congress 2021. , (2021).
- Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. Achieving better-than-3-Å resolution by single-particle cryo-EM at 200 keV. Nature Methods. 14 (11), 1075-1078 (2017).
- Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
- Wu, M., Lander, G. C., Herzik, M. A. Sub-2 Angstrom resolution structure determination using single-particle cryo-EM at 200 keV. Journal of Structural Biology X. 4, 100020-100029 (2020).
- Mori, T., et al. C-Glycoside metabolism in the gut and in nature: Identification, characterization, structural analyses and distribution of C-C bond-cleaving enzymes. Nature Communications. 12 (1), 6294 (2021).
- Hamdi, F., et al. 2.7 Å cryo-EM structure of vitrified M. musculus H-chain apoferritin from a compact 200 keV cryo-microscope. PLoS One. 15 (5), 0232540 (2020).
- Abbott, S., et al. EMDB web resources. Current Protocols in Bioinformatics. 61 (1), 1-12 (2018).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Gómez-Blanco, J., et al. Using Scipion for stream image processing at Cryo-EM facilities. Journal of Structural Biology. 204 (3), 457-463 (2018).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
- Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing ‘standard’ sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).
- Bloch, M., Santiveri, M., Taylor, N. M. I. Membrane protein Cryo-EM: Cryo-grid optimization and data collection with protein in detergent. Methods in Molecular Biology. 2127, 227-244 (2020).
- Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
- Schorb, M., et al. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Alewijnse, B., et al. Best practices for managing large CryoEM facilities. Journal of Structural Biology. 199, 225-236 (2017).
- Baldwin, P. R., et al. Big data in cryoEM: automated collection, processing and accessibility of EM data. Current Opinion in Microbiology. 43, 1-8 (2018).
- Guo, H., et al. Electron-event representation data enable efficient cryoEM file storage with full preservation of spatial and temporal resolution. International Union of Crystallography Journal. 7, 860-869 (2020).
- Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 76 (8), 724-728 (2020).
- Zhou, H., Chiu, W. Determination of icosahedral virus structures by electron cryomicroscopy at subnanometer resolution. Advances in Protein Chemistry. 64, 93-124 (2005).
- DeRosier, D. J. Correction of high-resolution data for curvature of the Ewald sphere. Ultramicroscopy. 81 (2), 83-98 (2000).
- Wolf, M., DeRosier, D. J., Grigorieff, N. Ewald sphere correction for single-particle electron microscopy. Ultramicroscopy. 106 (4-5), 376-382 (2006).
- Leong, P. A., Yu, X., Hong Zhou, Z., Jensen, G. J. Correcting for the ewald sphere in high-resolution single-particle reconstructions. Methods in Enzymology. 482, 369-380 (2010).
- Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 42166 (2018).
