描述了从犬肠和肝脏组织收获成体干细胞以建立3D类器官培养物的实验方法。此外,还讨论了确保持续生长并提供标准操作程序以收获,生物库和恢复犬肠道和肝脏类器官培养的实验室技术。
狗会发展出类似于人类的复杂多因素疾病,包括炎症性疾病,代谢性疾病和癌症。因此,它们代表了具有人类医学转化潜力的相关大型动物模型。类器官是3维(3D),自组装结构来自干细胞,模仿其起源器官的显微解剖学和生理学。这些转化 体外 模型可用于药物通透性和发现应用、毒理学评估,并提供对多因素慢性病病理生理学的机制理解。此外,犬类器官可以改善伴侣犬的生活,为兽医研究的各个领域提供投入,并促进兽医学中的个性化治疗应用。一小群供体可以创建类器官样品的生物库,从而减少连续组织收获的需求,因为类器官细胞系可以无限期地进行亚培养。本文介绍了三种方案,这些方案侧重于来自成体干细胞的肠和肝犬类器官的培养。犬类器官分离方案概述了处理组织和将细胞分离物嵌入支持基质(可溶的细胞外膜基质)的方法。犬类器官维持方案描述了类器官的生长和维护,包括清洁和传代以及适当的扩张时间。类器官摘取和生物样本库方案描述了提取,冷冻和保存类器官以进行进一步分析的方法。
啮齿动物是生物医学和转化研究中最常用的动物模型1。它们对于研究疾病的基本分子发病机制特别有用,尽管它们与慢性多因素疾病的临床相关性最近受到质疑2。与啮齿动物相比,犬类模型具有几个优点3,4。狗和人类在代谢组学和肠道微生物组学方面具有相似性,这些代谢组学和肠道微生物组是由于在驯化的不同时期食用人类饮食而发展起来的5,6,7。犬类与人体胃肠道解剖学和生理学之间的相似之处是另一个例子8。
此外,狗通常与主人共享相似的环境和生活方式9。与啮齿动物相比,狗的寿命更长,因此可以自然发展许多慢性疾病10。炎症性肠病或代谢综合征是人类和狗之间具有重要相似性的多因素慢性疾病的例子11,12。涉及患有自然发生疾病的狗的犬类临床前试验可以产生比啮齿动物模型更可靠的数据13。然而,为了尽量减少使用活体动物研究并遵守3R(减少,精炼,替换)14的原则,已经出现了使用3D体外犬类器官进行体内测试的替代方案15。
类器官是自组装的3D干细胞衍生结构,概括了其原始器官的生理学和显微解剖学16,17。该技术由Sato等人于2009年首次描述17 ,并且允许在上皮细胞系中进行比以前使用2D癌细胞培养物更可翻译的 体外 研究18,19,20。类器官在许多生物医学学科中是有用的 体外 模型,例如在临床前毒理学21,22,23,吸收或代谢研究中24,25,26,27,28,以及个性化医疗方法29,30,31.犬肠道类器官的成功培养在2019年首次被描述12,而Nantasanti等人于2015年首次报道了来自狗的肝脏类器官32。此后,犬类器官已成功用于调查犬类慢性肠病,胃肠道间质瘤,结直肠腺癌12和威尔逊氏病的研究33,34。
虽然成体干细胞可以通过尸检收获,但类器官技术并不总是需要牺牲动物。内窥镜和腹腔镜活检,甚至是器官细针抽吸术35,是用于上皮类器官分离的成体干细胞的可行来源12。在兽医实践中广泛使用这种非侵入性技术有助于反向转化研究的选择(将信息从兽医临床实践转换为人类临床实践,反之亦然)15。类器官技术的进一步发展可以通过类器官培养和维护方法的标准化来保证。这里介绍的类器官方案部分基于Saxena等人从201536年发表的工作,并且对方法进行了调整以适应犬肠道和肝脏类器官培养的具体情况。犬类器官实验方案的整体工作流程如图1所示。
犬类器官分离方案介绍了从内窥镜,腹腔镜和手术活检以及尸检中获取样本的方法。它概述了组织样本的初始预处理以及用于运输到实验室的方法。类器官分离所需的材料和试剂在“分离准备”一节中进行了总结。从组织样本中分离成体干细胞的过程进一步详细描述。最后,讨论了使用增溶的细胞外膜基质将类器官电镀成圆顶状结构的过程。
第二种方案,犬类器官维持方案,描述了记录和培养类器官的方法。本节将讨论媒体更改及其频率。此外,还描述了实验室程序,例如传代和清洁细胞培养物,这对于确保成功维护3D犬类器官至关重要。适当的传代是协议的关键步骤,手稿中将进一步讨论此步骤的可能调整和故障排除。
最后一个方案是犬类器官摘取和生物样本库方案,其中包含用于制备用于石蜡包埋和RNA保存的成熟类器官的方法。这里还描述了在液氮储存中生物样本库类器官样品的方法。最后,讨论了解冻冷冻样品并支持其生长的方法。
总之,本文旨在通过实验室间方案的标准化提供一致的犬类器官培养程序。在此过程中,该手稿旨在促进从犬类器官模型中提取的数据的可重复性,以增加其在转化生物医学研究中的相关性。
图1:犬类器官实验方案的工作流程。 犬类器官分离方案描述了类器官分离所需材料的制备,组织样本的收获(通过尸检,内窥镜,腹腔镜和手术活检),以及细胞群细胞解离和接种的指导。犬类器官维持方案讨论了类器官培养的清洁和传代。类器官摘取和生物样本库实验方案讨论了用于石蜡包埋和进一步类器官表征的类器官样品的制备。还讨论了生物库类器官培养物并将其从液氮储存中恢复的方法。 请点击此处查看此图的放大版本。
目前缺乏可用于分离和维持犬肝和肠道类器官的标准化方案。建立类器官培养的标准操作程序是必要的,以便该模型适用于不同的实验室环境。具体而言,为这些犬类器官模型的培养提供标准化的操作方案是表征类器官在培养和传代过程中的正常生长的关键,从而获得扩展和维持的最佳时间点。使用该协议培养的犬肠类器官先前已被Chandra等人表征12。
该协议最关键的步骤之一是类器官的传代。根据肝球体测量结果,确定肝球体首次通过的最佳时间是分离后的第7天。到第7天达到最大体积的球状体,同时,球体开始萌芽并形成肝脏类器官。从分离后的第2-7天开始,总类器官体积增加超过365倍,表明最佳通过时间比犬肠道类器官培养时间长。培养7天后,即使没有清洁或传代,也没有观察到肝球体细胞凋亡的严重迹象(图7)。肠道和肝脏类器官的传代可能具有挑战性,因为该过程可能导致细胞损失和活力改变。结果表明,肝脏类器官与胰蛋白酶样蛋白酶的长期孵育(长达12分钟)不会对传代培养产生负面影响。在胰蛋白酶样蛋白酶中孵育类器官超过24分钟可能对随后的类器官传代培养有害。
在类器官传代的细胞簇破损次优的情况下,机械解离而不是与胰蛋白酶样蛋白酶长期孵育可能更有益。如果在类器官的适当解离方面遇到问题,可以尝试对样品进行短暂的涡旋以提高通道产量。另一方面,涡旋有可能破坏培养物并损害细胞,因此只有在其他程序反复失败时才应使用它。将肝脏类器官分解成单个细胞会降低类器官的生长速率,而将它们分解成细胞簇可以大大提高它们的生存能力。选择十分钟作为类器官方案的孵育时间。与胰蛋白酶样蛋白酶实验中的24分钟孵育相比,12分钟的孵育时间点被认为没有细胞毒性。
生存能力实验证实,犬肝类器官可以在不利条件下存活长达19.5天(结构和营养枯竭)。在这些条件下存活时间最长的类器官用CMGF +培养基培养。这一观察结果可能是由于未补充Rock抑制剂和GSK3β的培养基中肝脏类器官生长较慢引起的。使用CMGF + R / G的类器官培养物生长得更快,并且可能更快地耗尽其资源。该实验为将犬类器官培养小型化以实现高通量系统转换开辟了可能性。这种技术显示出以大幅降低成本促进药物发现或毒理学研究的潜力。
在犬类器官培养维护过程中遇到的一些常见问题是电镀时样品凝固不当,培养污染以及建立类器官的适当密度和大小。如果溶解的ECM在电镀过程中过早凝固,请立即将其放在冰上10分钟。如果溶解的ECM没有形成圆顶状结构,则可能没有从样品中除去足够的培养基。如果是这种情况,请用更溶解的ECM稀释样品,直到形成圆顶。
当在整个板中发现真菌或细菌污染时(见 图4),最好的解决方案是丢弃板。可以尝试使用抗真菌药或抗生素药物治疗,但这种尝试的成功率极低。如果板中的单个孔被污染,则可以将可行和未受影响的孔清洁(按照步骤4.1至4.5)到新板并密切监测。如果样品已经过紧急冷冻,建议丢弃整个样品,因为解冻样品会使培养箱面临额外的污染风险。
健康的类器官培养应至少处于中等大小和中等密度类别或更大。最佳密度对于类器官培养生长至关重要。必须通过将类器官清洁到中等密度来校正较低的密度。如果发生极端密度的情况(过度拥挤),类器官应扩大到更多的孔。细胞凋亡的严重体征通常伴随过度拥挤和类器官培养密度低。如果这些问题没有及时纠正,整个类器官培养物将在几天内变成凋亡。如果类器官达到超大尺寸或非常高的密度,应将培养物用于实验,冷冻或固定。
类器官培养基目前含有17种成分,因此添加类器官维持和扩增所需的生长因子可能很昂贵。这个问题可以通过培养2D细胞培养物来解决,这些培养物合成生长因子以产生条件化的CMGF +。细胞培养L-WRN产生Wnt-3a,R-Spondin-3和Noggin生长因子37。细胞集落使用90%DMEM/F12和10%FBS培养基。当培养物达到90%的融合度时,每天收获培养基,持续1周。然后将收获的培养基与2x CMGF +(不含这些生长因子)混合。虽然2D培养物可以以一小部分成本产生所需的生长因子,但必须预期生产培养基的额外时间和准备工作。条件培养基批次之间的生长因子浓度也可能不同37,38。
犬类成体干细胞衍生的类器官培养物是一种独特的生物医学模型,可以帮助实现“一个健康倡议”的目标39。类器官技术可用于许多基础和生物医学研究领域,从发育生物学,病理生理学,药物发现和测试,毒理学到传染病和再生医学的研究40。转化和反向转化研究都是犬类器官适用的领域15。几个世纪以来,狗一直在转化实验环境中使用,它们的伴侣动物地位也促进了它们作为兽医学中最受探索的物种之一的地位。
总之,本手稿为犬类肝脏和肠道类器官的分离、维持、收获和生物样本库提供了标准化的操作规程,以促进该模型在各种生物医学领域的应用。该模型特别适合促进反向转化研究,作为“同一个健康”倡议的工具,以促进跨学科和跨学科的知识共享。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢爱荷华州立大学兽医诊断实验室的员工,即Haley M. Lambert,Emily Rahe,Rosalyn M. Branaman,Victoria J. Green和Jennifer M. Groeltz-Thrush,他们及时处理了所提供的样本。作者希望感谢教师创业,ISU VPR Miller奖,ISU VPR Miller奖和NSF SBIR子奖对ISU # 1912948的支持。
Chelating solution | |||
D-Sorbitol | Fisher Chemical | BP439-500 | |
DTT | Promega | V3151 | |
KCl | Fisher Chemical | P217-500 | |
KH2PO4 | Sigma | P5655-100G | |
Na2HPO4-2H2O | Sigma | S5136-100G | |
NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
Sucrose | Fisher Chemical | S5-500 | |
Organoid media | |||
[Leu15]-Gastrin I human | Sigma | G9145-.5MG | |
A-83-01 | PeproTech | 9094360 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
FBS | Corning | 35-010-CV | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | |
Human R-Spondin-1 | PeproTech | 120-38-500UG | |
Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | |
Murine Noggin | PeproTech | 250-38-250UG | |
Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | |
N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
ROCK inhibitor (Y-27632) | EMD Millipore Corp. | SCM 075 | |
SB202190 (P38 inhibitor) | Sigma | S7067-25MG | |
Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | Reprocell | 04-0004-base | |
Trimethoprim | Sigma | T7883-5G | |
Sulfamethoxazole | Sigma-Aldrich | S7507-10G | |
Reagents | |||
Acetic Acid, Glacial | Fisher Chemical | A38-500 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Chemicals | D128-500 | |
EDTA, pH 8.0, 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
Formaldehyde (37%) | Fisher Chemical | F79P-4 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882 | |
Matrigel Matrix For Organoid Culture | Corning | 356255 | Extracellular Membrane Matrix |
Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | |
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
RNAlater Soln. | Invitrogen | AM7021 | RNA Storage Reagent |
TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | Trypsin-like Protease |
Andere | |||
6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
ACD Hybez II Hybridization System | ACD a biotechne brand | 321710 | |
Centrifuge Tube, 15 mL | Corning | 430766 | |
CoolCell LX | Corning | BCS-405MC | |
Cryogenic Vials | Corning | 430488 | |
Disposable Centrifuge Tube (50 mL) | Fisherbrand | 05-539-13 | |
GyroMini Nutating mixer (Rocker) | Labnet | S0500-230V-EU | |
Heat Bath | Lab-Line Instruments | 3000 | |
Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | SpectrophotometerAnalysis |
Panasonic incubator | Panasonic | MCO-170ML-PA | |
Parafilm M Wrapping Film | Bemis Company Inc | PM996/EMD | Laboratory Flexible Film Tape |
Protected Disposable Scalpels | Bard-Parker | 239844 | |
RNAscope 2.5 HD Assay – RED | ACD a biotechne brand | 322350 | |
RNAscope H2O2 & Protease Plus Reagents | ACD a biotechne brand | 322330 | |
RNAscope Target Retrieval Reagents | ACD a biotechne brand | 322000 | |
RNAscope Wash Buffer Reagents | ACD a biotechne brand | 310091 | |
Tissue Culture Dish | Dot Scientific | 6676621 | |
Tissue Culture Plate 24 wells | Fisherbrand | FB012929 |