Decifrare il meccanismo molecolare dell'assemblaggio degli istoni mediante la tecnica della tenda del DNA

Il DNA eucariotico è impacchettato in una struttura di ordine superiore nota come cromatina ^1,2. Il nucleosoma è l’unità fondamentale della cromatina, che consiste di circa 147 bp di DNA avvolto attorno agli istoni del nucleo ottamerico ^3,4. La cromatina svolge un ruolo fondamentale nelle cellule eucariotiche; ad esempio, la struttura compatta protegge il DNA da fattori endogeni e minacce esogene⁵. La struttura della cromatina cambia dinamicamente in base alla fase del ciclo cellulare e agli stimoli ambientali, e questi cambiamenti controllano l’accesso alle proteine durante le transazioni del DNA come la replicazione, la trascrizione e la riparazione⁶. La dinamica della cromatina è importante anche per la stabilità genomica e l’informazione epigenetica.

La cromatina è regolata dinamicamente da vari fattori, tra cui le modificazioni della coda degli istoni e gli organizzatori della cromatina come i rimodellatori della cromatina, le proteine del gruppo polycomb e gli chaperoni istonici⁷. Gli chaperoni istonici coordinano l’assemblaggio e il disassemblaggio dei nucleosomi tramite deposizione o distacco degli istoni del nucleo ^8,9. I difetti negli chaperoni istonici inducono instabilità del genoma e causano disturbi dello sviluppo e cancro ^9,10. Vari chaperoni istonici non necessitano di un consumo di energia chimica come l’idrolisi dell’ATP per assemblare o disassemblare i nucleosomi 9,11,12,13. Recentemente, i ricercatori hanno riferito che le ATPasi AAA+ (ATPasi associate a diverse attività cellulari) contenenti bromodominio svolgono un ruolo nella dinamica della cromatina come chaperoni^istonici 14,15,16,17. L’ATAD2 umano (proteina 2 contenente il dominio AAA della famiglia ATPasi) promuove l’accessibilità della cromatina per migliorare l’espressione genica¹⁸. Come co-regolatore trascrizionale, ATAD2 regola la cromatina dei fattori trascrizionali oncogenici¹⁴ e la sovraespressione di ATAD2 è correlata a una prognosi sfavorevole in molti tipi di cancro¹⁹. Yta7, l’omologo di Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) di ATAD2, diminuisce la densità nucleosomica nella cromatina¹⁵. Al contrario, Abo1, l’omologo di Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) di ATAD2, aumenta la densità del nucleosoma¹⁶. Utilizzando una tecnica di imaging unica a singola molecola, la cortina di DNA, se Abo1 contribuisce all’assemblaggio o al disassemblaggio del nucleosoma viene affrontata^17,20.

Tradizionalmente, le proprietà biochimiche delle biomolecole sono state esaminate mediante esperimenti di massa come il saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) o la co-immunoprecipitazione (co-IP), in cui viene sondato un gran numero di molecole e le loro proprietà medie sono caratterizzate^21,22. Negli esperimenti di massa, i sottostati molecolari sono velati dall’effetto della media d’insieme e l’indagine sulle interazioni biomolecolari è limitata. Al contrario, le tecniche a singola molecola aggirano i limiti degli esperimenti di massa e consentono la caratterizzazione dettagliata delle interazioni biomolecolari. In particolare, le tecniche di imaging a singola molecola sono state ampiamente utilizzate per studiare le interazioni DNA-proteina e proteina-proteina²³. Una di queste tecniche è la tenda del DNA, una tecnica di imaging unica a singola molecola basata sulla microfluidica e sulla microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRFM)^24,25. In una cortina di DNA, centinaia di singole molecole di DNA sono ancorate al doppio strato lipidico, che consente il movimento bidimensionale delle molecole di DNA grazie alla fluidità lipidica. Quando viene applicato il flusso idrodinamico, le molecole di DNA si muovono lungo il flusso sul doppio strato e rimangono bloccate in corrispondenza di una barriera di diffusione, dove vengono allineate e allungate. Mentre il DNA viene colorato con agenti intercalanti, vengono iniettate proteine marcate in modo fluorescente e TIRFM viene utilizzato per visualizzare le interazioni proteina-DNA in tempo reale a livello di singola molecola²³. La piattaforma a cortina di DNA facilita l’osservazione dei movimenti delle proteine come la diffusione, la traslocazione e la collisione 26,27,28. Inoltre, la cortina del DNA può essere utilizzata per la mappatura di proteine su DNA con posizioni, orientamenti e topologie definite o applicata allo studio della separazione di fase di proteine e acidi nucleici 29,30,31.

In questo lavoro, la tecnica del DNA curtain viene utilizzata per fornire prove della funzione degli chaperoni attraverso la visualizzazione diretta di proteine specifiche. Inoltre, poiché DNA curtain è una piattaforma ad alto rendimento, facilita una quantità di raccolta dati sufficiente per l’affidabilità statistica. Qui, viene descritto in dettaglio come condurre il test della tenda del DNA per studiare il ruolo molecolare di S. pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase Abo1.