DNA 커튼 기법에 의한 히스톤 조립의 분자 메커니즘 해독
Summary
고처리량 단일 분자 이미징 기술인 DNA 커튼은 다양한 단백질-DNA 상호 작용의 실시간 시각화를 위한 플랫폼을 제공합니다. 본 프로토콜은 DNA 커튼 기술을 활용하여 Schizosaccharomyces pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase인 Abo1의 생물학적 역할과 분자 메커니즘을 조사합니다.
Abstract
크로마틴은 진핵생물 DNA를 포장하는 고차원 구조입니다. 크로마틴은 세포 주기 단계와 환경 자극에 대한 반응에 따라 동적 변화를 겪습니다. 이러한 변화는 게놈 무결성, 후성유전학적 조절 및 복제, 전사 및 복구와 같은 DNA 대사 반응에 필수적입니다. 염색질 조립은 염색질 역학에 매우 중요하며 히스톤 샤페론에 의해 촉매됩니다. 광범위한 연구에도 불구하고 히스톤 샤페론이 염색질 조립을 가능하게 하는 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵습니다. 더욱이, 히스톤 샤페론(histone chaperone)에 의해 조직된 뉴클레오솜(nucleosome)의 전반적인 특징은 잘 이해되지 않고 있다. 이 문제를 다루기 위하여는, 이 일은 히스톤 chaperones에 의하여 뉴클레오솜 집합의 분자 세부사항의 수사를 촉진하는 DNA 커튼이라고 지명된 유일한 단 하나 분자 화상 진찰 기술을 기술합니다. DNA 커튼은 지질 유동성, 미세유체역학 및 전반사 형광 현미경(TIRFM)을 결합하여 다양한 단백질-DNA 상호 작용의 실시간 이미징을 위한 범용 플랫폼을 제공하는 하이브리드 기술입니다. DNA 커튼을 사용하여 Abo1의 히스톤 샤페론 기능, Schizosaccharomyces pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase를 조사하고 Abo1의 히스톤 조립의 기저에 있는 분자 메커니즘을 밝힙니다. DNA 커튼은 염색질 역학을 연구하기 위한 독특한 접근 방식을 제공합니다.
Introduction
진핵생물 DNA는 염색질 1,2로 알려진 고차원 구조로 포장되어 있습니다. 뉴클레오솜은 크로마틴의 기본 단위로, 팔각형 코어 히스톤 3,4를 감싸고 있는 약 147bp DNA로 구성됩니다. 염색질은 진핵 세포에서 중요한 역할을합니다. 예를 들어, 조밀한 구조는 내인성 요인과 외인성 위협으로부터 DNA를 보호한다5. 염색질 구조는 세포주기 단계와 환경 자극에 따라 동적으로 변화하며, 이러한 변화는 복제, 전사 및 복구와 같은 DNA 거래 중에 단백질 접근을 제어한다6. 염색질 역학은 게놈 안정성과 후성유전학적 정보에도 중요합니다.
염색질은 히스톤 꼬리 변형 및 염색질 리모델러, 폴리콤 그룹 단백질 및 히스톤 샤페론과 같은 염색질 조직자를 포함한 다양한 요인에 의해 동적으로 조절됩니다7. 히스톤 샤페론은 코어 히스톤의 증착 또는 분리를 통해 뉴클레오솜의 조립 및 분해를 조정합니다 8,9. 히스톤 샤페론의 결함은 게놈 불안정성을 유발하고 발달 장애와 암을 유발한다 9,10. 다양한 히스톤 샤페론은 뉴클레오솜 9,11,12,13을 조립하거나 분해하기 위해 ATP 가수 분해와 같은 화학적 에너지 소비가 필요하지 않습니다. 최근 연구자들은 브로모도메인 함유 AAA+(다양한 세포 활동과 관련된 ATPase) ATPase가 히스톤 샤페론 14,15,16,17로 염색질 역학에서 역할을 한다고 보고했습니다. 인간 ATAD2(ATPase 계열 AAA 도메인 함유 단백질 2)는 염색질 접근성을 촉진하여 유전자 발현을 향상시킵니다18. 전사 공동-조절자로서, ATAD2는 발암성 전사인자(oncogenic transcriptional factor)의 염색질을 조절하며(14), ATAD2의 과발현은 많은 유형의 암에서 나쁜 예후와 관련이 있다19. ATAD2의 맥주효모균(S. cerevisiae) 상동체인 Yta7은 염색질15의 뉴클레오솜 밀도를 감소시킵니다. 대조적으로, ATAD2의 Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) 상동체인 Abo1은 뉴클레오솜 밀도16을 증가시킨다. 독특한 단일 분자 이미징 기술인 DNA 커튼을 사용하여 Abo1이 뉴클레오솜 조립 또는 분해에 기여하는지 여부를 다룹니다17,20.
전통적으로 생체 분자의 생화학적 특성은 많은 수의 분자를 조사하는 EMSA(electrophoretic mobility shift assay) 또는 co-immunoprecipitation(co-IP)과 같은 벌크 실험에 의해 조사되어 왔으며 평균 특성은21,22를 특성화합니다. 대량 실험에서 분자 하위 상태는 앙상블 평균 효과에 의해 가려지며 생체 분자 상호 작용 조사가 제한됩니다. 대조적으로, 단일 분자 기술은 대량 실험의 한계를 우회하고 생체 분자 상호 작용의 상세한 특성 분석을 가능하게 합니다. 특히, 단일 분자 이미징 기술은 DNA-단백질 및 단백질-단백질 상호 작용을 연구하는 데 널리 사용되었습니다23. 그러한 기술 중 하나는 DNA 커튼, 미세 유체 역학 및 전체 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM) 24,25을 기반으로 한 독특한 단일 분자 이미징 기술입니다. DNA 커튼에서는 수백 개의 개별 DNA 분자가 지질 이중층에 고정되어 지질 유동성으로 인해 DNA 분자의 2차원 운동을 허용합니다. 유체역학적 흐름이 적용되면 DNA 분자는 이중층의 흐름을 따라 이동하고 확산 장벽에 갇혀 정렬되고 늘어납니다. DNA가 삽입제로 염색되는 동안 형광 표지된 단백질이 주입되고 TIRFM을 사용하여 단일 분자 수준23에서 실시간으로 단백질-DNA 상호 작용을 시각화합니다. DNA 커튼 플랫폼은 확산, 전위 및 충돌과 같은 단백질 이동의 관찰을 용이하게 합니다 26,27,28. 또한, DNA 커튼은 정의된 위치, 방향 및 토폴로지를 가진 DNA에 대한 단백질 매핑에 사용되거나 단백질과 핵산의 상 분리 연구에 적용될 수 있습니다 29,30,31.
이 연구에서 DNA 커튼 기술은 특정 단백질의 직접적인 시각화를 통해 샤페론의 기능에 대한 증거를 제공하는 데 사용됩니다. 또한, DNA 커튼은 처리량이 많은 플랫폼이기 때문에 통계적 신뢰성에 충분한 데이터 수집을 용이하게 합니다. 여기에서는 S. pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase Abo1의 분자 역할을 조사하기 위해 DNA 커튼 분석을 수행하는 방법을 자세히 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
단일 분자 이미징 기술로서, DNA 커튼은 DNA 대사 반응을 조사하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다43. DNA 커튼은 지질 유동성, 미세유체역학 및 TIRFM을 연결하는 하이브리드 시스템입니다. 다른 단일 분자 기술과 달리 DNA 커튼은 단백질-DNA 상호 작용의 고처리량 실시간 시각화를 가능하게 합니다. 따라서 DNA 커튼 기술은 염기서열 특이적 연관성, DNA와 함께 단백질 이동, DNA 17,20,26에 ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 한국과학기술원(KAIST)의 송지준 교수, Carol Cho 박사, 장주원 교수의 Abo1 및 Cy5-H3-H4에 대한 친절한 지원에 감사드립니다. 본 연구는 국립연구재단 지원금(NRF-2020R1A2B5B01001792), 울산과학기술원 교내 연구비(1.210115.01), 기초과학연구원(IBS-R022-D1)의 지원을 받고 있다.
Materials
| 1 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 301321 | |
| 1' x 3' fused-silca slide glass | G. Finkenbeiner | 1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness | |
| 10 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302149 | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti | 850375 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 Biotinyl cap PE | Avanti | 870273 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 PEG2000 PE | Avanti | 880130 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 3 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302832 | |
| 6-way sample injection valve | IDEX | MX series II | |
| 950K PMMA | All-resist | 671.04 | |
| Acetone | SAMCHUN | A1759 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| Aluminum (Al) | TASCO, South Korea | LT50AI414 | Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch |
| Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa | Millipore | Z648027 | |
| Ampicillin | Mbcell | MB-A4128 | Antibiotics |
| AZ 300 MIF developer | Merck | 10454110521 | Used for removing aluminum |
| Blade | DORCO | DN52 | 12 mm x 6 m |
| Boron trichloride (BCl3) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Catalase | Sigma | C40-1g | This is a component of 100x gloxy stock |
| Chlorine (Cl2) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Clear double-sided tape | 3M | 313770 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| DC sputter | Sorona | SRM-120 | Used for deposition aluminum on a slide |
| Diamond-coated drill bit | Eurotool | DIB-211.00 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| Dove-prism | Korea Electro-Optics Co. Ltd. | 1906-106 | Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| Electron Bean Lithography | Nanobeam Ltd. | NB3 | |
| Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-1KG | |
| Fingertight fittings | IDEX | F-300 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Flangeless male nut | IDEX | P-235 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Freeze Dryer, HyperCOOL | Labogene | HC3110 | Used for lyophilizing liquid proteins |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133-50KU | This is a component of 100x gloxy stock |
| Guanidinium hydrochloride | Acros Organics | 364790025 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company | 80065 | This syringe is used for sample injection |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | |
| HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg | Cytiva | 28-9893-36 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Hot plate stirrer | Corning | PC-420D | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1759 | Used for Tris-HCl |
| Index matching oil | ZEISS | 444970-9000-000 | |
| Inductively coupled plasma-reactive ion etching | Top Technology Ltd. | FabStar | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Glentham Life Sciences | GC6586-100g | Used for induction of β-galactosidase activity |
| Lambda phage DNA | NEB | N0311 | |
| LB broth | BD difco | 244610 | Media for E.coli cell growth |
| Luer adapter 10-32 | IDEX | P-659 | This connects luer-lock syringe and tubing |
| Magnesium chloride hexahydrate | fisher bioreagents | BP214 | |
| Methyl isobutyl ketone (MIBK) | KAYAKU ADVANCED MATERIALS | Used for developing solution | |
| Microscope (Eclipse Ti2) | Nikon | Eclipse Ti2 | Inverted fluorescence microscope |
| Microscope glass coverslip | MARIENFELD | 101142 | 22 x 50 mm (No. 1) |
| Microscope slide | DURAN GROUP | DU.2355013 | Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm |
| Nanoport | IDEX | N-333-01 | |
| Objective lens | Nikon | CFI Plan Apochromat VC 60XC WI | Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28) |
| One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C6060-03 | Competent cell for overexpressing proteins |
| Oxygen (O2) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| PFA tubing natural | IDEX | 1512L | It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche | 11359061001 | Protease inhibitor |
| Sephacryl S-200 High Resolution | Cytiva | 17-0584-01 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Shut-off valve | IDEX | P-732 | |
| Sodium acetate | Sigma | 791741 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | s5881 | |
| Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa | Spectrum laboratories | 132660 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | S888 | |
| Sulfur tetralfluoride (SF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| Syringe pump | KD Scientific | 78-8210 | |
| Tetrafluoromethane (CF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Used for Tris-HCl |
| TSKgel SP-5PW | TOSOH | 14715 | Used for FPLC (ion exchange) |
| Union assembly | IDEX | P-760 | This connects tubings |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Vacuum oven | Jeio Tech | OV-11 | |
| YOYO-1 | Thermo Fisher Scientific | Y3601 | This intercalation dye is diluted in DMSO |
| β-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M6250 |
Referenzen
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