DNAカーテン法によるヒストン集合の分子機構の解明

真核生物のDNAは、クロマチン^1,2として知られる高次構造にパッケージ化されています。ヌクレオソームはクロマチンの基本単位であり、オクタメリックコアヒストンに巻き付いた約147 bpのDNAから構成されています^3,4。クロマチンは真核細胞において重要な役割を果たします。例えば、コンパクトな構造は、内因性因子や外因^{性の脅威から}DNAを保護します5。クロマチンの構造は、細胞周期の段階や環境刺激に応じてダイナミックに変化し、複製、転写、修復などのDNAトランザクションにおけるタンパク質のアクセスを制御しています⁶。クロマチン動態は、ゲノムの安定性やエピジェネティックな情報にとっても重要です。

クロマチンは、ヒストン尾部修飾やクロマチンリモデラー、ポリコーム群タンパク質、ヒストンシャ^{ペロンなどの}クロマチンオーガナイザーなど、さまざまな要因によって動的に制御されています7。ヒストンシャペロンは、コアヒストンの堆積または剥離を介してヌクレオソームの組み立てと分解を調整します^8,9。ヒストンシャペロンの欠損はゲノムの不安定性を誘発し、発達障害や癌を引き起こします^9,10。様々なヒストンシャペロンは、ヌクレオソームを組み立てたり分解したりするためにATP加水分解のような化学的エネルギー消費を必要としません^9,11,12,13。最近、研究者らは、ブロモドメインを含むAAA+(多様な細胞活性に関連するATPアーゼ)ATPアーゼが、ヒストンシャペロンとしてクロマチン動態に関与していることを報告しました^14,15,16,17。ヒトATAD2(ATPaseファミリーAAAドメイン含有タンパク質2)は、クロマチンのアクセシビリティを促進し、遺伝子発現を増強する¹⁸。転写共調節因子として、ATAD2は発がん性転写因子のクロマチンを調節しており¹⁴、ATAD2の過剰発現は多くの種類の癌における予後不良と関連している¹⁹。ATAD2の出芽酵母(S. cerevisiae)ホモログであるYta7は、クロマチン¹⁵のヌクレオソーム密度を低下させる。対照的に、ATAD2の分裂分裂菌(S. pombe)ホモログであるAbo1は、ヌクレオソーム密度を増加させる¹⁶。独自の単一分子イメージング技術であるDNAカーテンを用いて、Abo1がヌクレオソームの組み立てまたは分解に寄与するかどうかが取り上げられる^17,20。

従来、生体分子の生化学的特性は、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)や共免疫沈降(co-IP)などのバルク実験によって調べられており、多数の分子が調べられ、それらの平均特性が特徴付けられています^21,22。バルク実験では、分子のサブステートはアンサンブル平均効果によってベールに包まれ、生体分子相互作用の探索は制限されます。対照的に、単一分子技術はバルク実験の限界を回避し、生体分子相互作用の詳細な特性評価を可能にします。特に、単一分子イメージング技術は、DNA-タンパク質およびタンパク質-タンパク質相互作用の研究に広く使用されている²³。そのような技術の1つが、マイクロ流体工学と全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)に基づく独自の単一分子イメージング技術であるDNAカーテンです^24,25。DNAカーテンでは、何百もの個々のDNA分子が脂質二重層に固定されており、脂質の流動性によりDNA分子の2次元運動が可能になります。流体力学的流れが適用されると、DNA分子は二重層上の流れに沿って移動し、拡散障壁に引っかかり、そこで整列して引き伸ばされます。DNAをインターカレート剤で染色しながら、蛍光標識タンパク質を注入し、TIRFMを使用してタンパク質-DNA相互作用を1分子レベルでリアルタイムに可視化します²³。DNAカーテンプラットフォームは、拡散、転座、衝突などのタンパク質の動きの観察を容易にします26,27,28。さらに、DNAカーテンは、定義された位置、配向、およびトポロジーを持つDNAのタンパク質マッピングに使用したり、タンパク質と核酸の相分離の研究に適用したりできます29,30,31。

この研究では、DNAカーテン技術を使用して、特定のタンパク質を直接可視化することにより、シャペロンの機能の証拠を提供します。さらに、DNAカーテンはハイスループットプラットフォームであるため、統計的信頼性に十分なデータ収集が容易になります。ここでは、 S. pombe bromodomain含有AAA+ ATPase Abo1の分子的役割を調べるためのDNAカーテンアッセイの実施方法について詳細に説明する。