Entschlüsselung des molekularen Mechanismus der Histonassemblierung mittels DNA-Vorhangtechnik

Eukaryotische DNA ist in eine Struktur höherer Ordnung verpackt, die als Chromatin ^1,2 bekannt ist. Das Nukleosom ist die grundlegende Einheit des Chromatins, das aus etwa 147 bp DNA besteht, die um die oktameren Kernhistone ^3,4 gewickelt ist. Chromatin spielt eine entscheidende Rolle in eukaryotischen Zellen; So schützt die kompakte Struktur die DNA vor endogenen Faktoren und exogenen Bedrohungen⁵. Die Chromatinstruktur ändert sich dynamisch in Abhängigkeit von der Zellzyklusphase und Umweltreizen, und diese Veränderungen steuern den Proteinzugang während DNA-Transaktionen wie Replikation, Transkription und Reparatur⁶. Die Chromatindynamik ist auch wichtig für die genomische Stabilität und die epigenetische Information.

Chromatin wird dynamisch durch verschiedene Faktoren reguliert, darunter Histonschwanzmodifikationen und Chromatinorganisatoren wie Chromatin-Remodeler, Polycomb-Gruppenproteine und Histon-Chaperone⁷. Histon-Chaperone koordinieren den Auf- und Abbau von Nukleosomen durch Abscheidung oder Ablösung von Kernhistonen ^8,9. Defekte in Histon-Chaperonen induzieren Genominstabilität und verursachen Entwicklungsstörungen und Krebs ^9,10. Verschiedene Histon-Chaperone benötigen keinen chemischen Energieverbrauch wie ATP-Hydrolyse, um Nukleosomen 9,11,12,13 zu montieren oder zu zerlegen. Kürzlich berichteten Forscher, dass Bromodomänen-haltige AAA+-ATPasen (ATPase, die mit verschiedenen zellulären Aktivitäten assoziiert sind) eine Rolle bei der Chromatindynamik als Histon-Chaperone spielen 14,15,16,17. Humanes ATAD2 (ATPase-Familie AAA-Domänen-enthaltendes Protein 2) fördert die Zugänglichkeit von Chromatinen, um die Genexpression zu verbessern¹⁸. Als transkriptioneller Co-Regulator reguliert ATAD2 das Chromatin onkogener Transkriptionsfaktoren¹⁴, und die Überexpression von ATAD2 ist bei vielen Krebsarten mit einer schlechten Prognose verbunden¹⁹. Yta7, das Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae)-Homolog von ATAD2, verringert die Nukleosomendichte in Chromatin¹⁵. Im Gegensatz dazu erhöht Abo1, das Homolog von ATAD2 von Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), die Nukleosomendichte¹⁶. Mit Hilfe einer einzigartigen Einzelmolekül-Bildgebungstechnik, dem DNA-Vorhang, wird untersucht, ob Abo1 zum Auf- oder Abbau von Nukleosomen beiträgt^17,20.

Traditionell wurden die biochemischen Eigenschaften von Biomolekülen durch Massenexperimente wie den elektrophoretischen Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) oder die Co-Immunpräzipitation (co-IP) untersucht, bei denen eine große Anzahl von Molekülen untersucht und ihre durchschnittlichen Eigenschaften charakterisiert werden^21,22. In Massenexperimenten werden molekulare Unterzustände durch den Ensemble-Mittelwert-Effekt verschleiert, und die Untersuchung biomolekularer Wechselwirkungen ist eingeschränkt. Im Gegensatz dazu umgehen Einzelmolekültechniken die Einschränkungen von Massenexperimenten und ermöglichen die detaillierte Charakterisierung biomolekularer Wechselwirkungen. Insbesondere Einzelmolekül-Bildgebungsverfahren werden häufig zur Untersuchung von DNA-Protein- und Protein-Protein-Wechselwirkungen eingesetzt²³. Eine dieser Techniken ist der DNA-Vorhang, ein einzigartiges Einzelmolekül-Bildgebungsverfahren, das auf Mikrofluidik und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ^basiert24,25. In einem DNA-Vorhang sind Hunderte von einzelnen DNA-Molekülen an der Lipiddoppelschicht verankert, die aufgrund der Lipidfluidität die zweidimensionale Bewegung von DNA-Molekülen ermöglicht. Wenn eine hydrodynamische Strömung angewendet wird, bewegen sich DNA-Moleküle entlang der Strömung auf der Doppelschicht und bleiben an einer Diffusionsbarriere hängen, wo sie ausgerichtet und gestreckt werden. Während die DNA mit Interkalationsmitteln gefärbt wird, werden fluoreszenzmarkierte Proteine injiziert, und TIRFM wird verwendet, um Protein-DNA-Wechselwirkungen in Echtzeit auf Einzelmolekülebene zu visualisieren²³. Die DNA-Vorhangplattform erleichtert die Beobachtung von Proteinbewegungen wie Diffusion, Translokation und Kollision 26,27,28. Darüber hinaus kann der DNA-Vorhang für die Proteinkartierung auf DNA mit definierten Positionen, Orientierungen und Topologien oder für die Untersuchung der Phasentrennung von Proteinen und Nukleinsäuren verwendet werden 29,30,31.

In dieser Arbeit wird die DNA-Vorhang-Technik verwendet, um den Nachweis für die Funktion von Chaperonen durch direkte Visualisierung spezifischer Proteine zu erbringen. Da es sich bei DNA-Vorhang um eine Hochdurchsatzplattform handelt, ermöglicht es außerdem einen Umfang der Datenerfassung, der für die statistische Zuverlässigkeit ausreicht. Hier wird beschrieben, wie der DNA-Vorhang-Assay im Detail durchgeführt wird, um die molekulare Rolle der S. pombe Bromodomänen-haltigen AAA+ ATPase Abo1 zu untersuchen.