En TNBS-inducerad gnagaremodell för att studera den patogena rollen av mekanisk stress i Crohns sjukdom
Summary
Det föreliggande protokollet beskriver utvecklingen av en Crohns-liknande kolitmodell hos gnagare. Transmural inflammation leder till stenos vid TNBS-instillationsstället, och mekanisk utvidgning observeras i segmentet proximalt till stenosen. Dessa förändringar gör det möjligt att studera mekanisk stress vid kolit.
Abstract
Inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD) som Crohns sjukdom (CD) är kroniska inflammatoriska störningar i mag-tarmkanalen som påverkar cirka 20 per 1 000 000 i Europa och USA. CD kännetecknas av transmural inflammation, tarmfibros och luminal stenos. Även om antiinflammatoriska terapier kan hjälpa till att kontrollera inflammation, har de ingen effekt på fibros och stenos i CD. Patogenesen av CD är inte väl förstådd. Aktuella studier fokuserar främst på att avgränsa dysreglerade tarmimmunsvarsmekanismer. Medan CD-associerad transmural inflammation, tarmfibros och luminal stenos alla representerar mekanisk stress på tarmväggen, är rollen som mekanisk stress i CD inte väl definierad. För att avgöra om mekanisk stress spelar en oberoende patogen roll i CD har ett protokoll för TNBS-inducerad CD-liknande kolitmodell hos gnagare utvecklats. Denna TNBS-inducerade transmurala inflammations- och fibrosmodell liknar patologiska kännetecken för CD i tjocktarmen. Det induceras av intrakolonisk instillation av TNBS i distal kolon hos vuxna Sprague-Dawley-råttor. I denna modell leder transmural inflammation till stenos vid TNBS-instillationsstället (site I). Mekanisk distans observeras i den del som är proximal till instillationsstället (site P), vilket representerar mekanisk stress men inte synlig inflammation. Kolondelen distal till inflammation (plats D) presenterar varken inflammation eller mekanisk stress. Distinkta förändringar av genuttryck, immunsvar, fibros och glattmuskeltillväxt på olika platser (P, I och D) observerades, vilket belyser en djupgående inverkan av mekanisk stress. Därför kommer denna modell av CD-liknande kolit att hjälpa oss att bättre förstå CD: s patogena mekanismer, särskilt rollen som mekanisk stress och mekaniskt stressinducerat genuttryck i immundysregulering, tarmfibros och vävnadsombyggnad i CD.
Introduction
Inflammatorisk tarmsjukdom (IBD), inklusive ulcerös kolit (UC) och Crohns sjukdom (CD), kännetecknas av kronisk inflammation i mag-tarmkanalen (GI). Det påverkar ~ 1-2 miljoner amerikaner1. De beräknade årliga kostnaderna för IBD-vård i USA är 11,8 miljarder dollar. Till skillnad från UC kännetecknas CD-skivan av transmural inflammation och strikturbildning 2,3. Strikturbildning (stenos) förekommer hos upp till 70 % av CD-patienterna3 och kan orsakas av transmural inflammation (inflammatorisk stenos) eller tarmfibros (fibrotisk stenos)4,5. Tarmfibros kännetecknas av överdriven kollagenavsättning och andra extracellulära matriser (ECM) med glattmuskelceller (SMC) som en av de viktigaste mesenkymala celltyperna som är involverade i processen 3,4. Glatt muskelhyperplasi associerad med hypertrofi är en annan signifikant histologisk förändring i fibrotisk stenos i CD6. Även om strikturbildning i CD är förknippad med kronisk inflammation, är ingen antiinflammatorisk behandling effektiv, förutom kirurgisk behandling 2,6. Återfall efter operationen är dock nästan 100%, givet tillräcklig tid 2,7. Som ett inflammatoriskt svar kan fibros och SMC-hyperplasi också utvecklas vid icke-inflammatoriska tillstånd (dvs. tarmobstruktion) i tarmen 8,9; man tror att både inflammationsberoende och oberoende mekanismer är involverade i strikturbildning 3,4. Med tanke på att omfattande forskning om de inflammationsberoende mekanismerna inte har översatts till någon effektiv terapi för strikturbildning behövs studier av den möjliga rollen av inflammationsoberoende mekanismer i tarmfibros.
Som en icke-inflammatorisk faktor är mekanisk stress (MS) associerad med ödem, inflammatorisk cellinfiltration, vävnadsdeformation, fibros och stenos 10,11,12,13 vanligt förekommande i IBD, särskilt CD, som kännetecknas av transmural inflammation. Mekanisk stress är mest anmärkningsvärd i stenotisk CD, där stenos (inflammatorisk eller fibrotisk) i inflammationsstället presenterar mekanisk stress i den lokala vävnaden och leder till lumendistans i segmentet proximalt till obstruktionsstället10,14. Tidigare in vitro-studier har visat att mekanisk stress förändrar genuttryck av specifika inflammatoriska mediatorer (dvs. COX-2, IL-6)8,14,15 och tillväxtfaktorer (dvs. TGF-β) i mag-tarmvävnaderna, särskilt tarms glatta muskelceller (SMC)16. Nyligen genomförda studier visade också att uttrycket av specifika profibrotiska mediatorer såsom bindvävstillväxtfaktor (CTGF) är mycket känsligt för mekanisk stress17,18. Det antogs att mekanisk stress kan spela en oberoende patogen roll i CD-associerad inflammation, fibros och vävnadsombyggnad. Den patogena betydelsen av mekanisk stress vid tarminflammation, fibros och glattmuskelhyperplasi i CD förblir emellertid i stort sett outforskad. Detta kan delvis bero på att inflammation är en mer synlig och bättre studerad process än mekanisk stress. Ännu viktigare är att det inte har funnits någon väldefinierad djurmodell av IBD för att skilja effekten av mekanisk stress från inflammation.
Det aktuella arbetet beskriver en gnagarmodell av Crohns-liknande kolit inducerad genom intrakolonisk injektion av haptenreagens 2,4,6-trinitrobensensulfonsyra (TNBS)19,20, som kan tjäna syftet att studera rollen som mekanisk stress i CD. Det visade sig att TNBS-instillation inducerade en lokaliserad (~ 2 cm lång) transmural inflammation med lumens förträngning (stenos) i den distala tjocktarmen. Stenosen leder till markant tarmdistans (mekanisk stress)14,15 men inte synlig inflammation i kolonsegmentet proximalt till instillationsstället. Tvärtom presenterar kolonsegmentet distalt till stenosstället varken inflammation eller mekanisk stress. Signifikanta platsspecifika förändringar i genuttryck, inflammation, fibros och SMC-hyperplasi observerades på de tre olika platserna. Resultaten tyder på att mekanisk stress, särskilt mekaniskt stressinducerat genuttryck, kan spela en avgörande roll för att utveckla fibros och hyperplasi i Crohns kolit.
Protocol
Representative Results
Discussion
TNBS-inducerad kolit introducerades 1989 och har använts som en experimentell modell av Crohns sjukdom sedan dess 19,20,23. Betydande egenskaper hos denna modell hos gnagare inkluderar utvecklingen av en transmural inflammation som liknar de histopatologiska lesionerna som utvecklats vid mänsklig Crohns sjukdom19,20. Tidigare studier på modellen har främst fokuserat …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds delvis av bidrag från NIH (R01 DK124611 till XZS) och det amerikanska försvarsdepartementet (W81XWH-20-1-0681 till XZS). Histologiarbetet gjordes med hjälp av UTMB Surgical Pathology Lab.
Materials
| ACT-1 Control Software Ver2.63 | Nikon | DXM1200F | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module | BIO-RAD | 1851196 | |
| CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems | BIO-RAD | 1845097 | |
| Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer | Dako | AR310 | |
| Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 | Dako | AR173 | |
| DXM1200 Digital Color HR Camera | Nikon | DXM1200 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | ThermoFisher Scientific | 4352930E | |
| E-Z Anesthesia | E-Z Systems Inc. | EZ-155 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad | 9.0.2 (161) | |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | BIO-RAD | HSP9601 | |
| HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) | CORNING | 21-021-CV | |
| HM 325 Microtome | Thermo Scientific | 23-900-667 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-10 | |
| LI-COR Odyssey Digital Imaging System | LI-COR | 9120 | |
| Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler | Eppendorf | 5341 | |
| Medical grade open end polyurethane catheter | Covidien | 8890703013 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Nikon Eclipse E800 Upright Microscope | Nikon | E800 | |
| Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm | BIO-RAD | 1620215 | |
| Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative | Miralax | C8175 | Dose: 17g in 226 mL of water |
| RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers |
QIAGEN | 74106 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4444557 | |
| Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 | Sakura | 6190 | |
| Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer | Sakura | 6171 | |
| TNBS (Picrylsulfonic acid solution) | SIGMA-ALDRICH | 92822 |
Referenzen
- Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn’s disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
- Hwang, J. M., Varma, M. G. Surgery for inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).
- Latella, G., Rieder, F. Intestinal fibrosis: Ready to be reversed. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).
- Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).
- Bettenworth, D., et al. Assessment of Crohn’s disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review. Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).
- Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn’s fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme. Journal of Crohn’s and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).
- Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. Natural course of Crohn’s disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms. Gut. 33 (3), 331-335 (1992).
- Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence. PLoS One. 9, 106242 (2014).
- Gabella, G., Yamey, A. Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine. Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).
- Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease. Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).
- Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
- Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
- Cox, C. S., et al. Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance. Shock. 29 (5), 598-602 (2008).
- Shi, X. Z. Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells. Frontiers in Physiology. 8, 1000 (2017).
- Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).
- Gutierrez, J. A., Perr, H. A. Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).
- Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 5, 24 (2012).
- Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins. The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).
- Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn’s colitis and ulcerative colitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).
- Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).
- Shi, X. Z., Sarna, S. K. Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).
- Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).
- Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Mudter, J., Neurath, M. F. Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance. Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).
- Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders. Frontiers in Pharmacology. 12, 809350 (2021).
