استراتيجيات التلقيح لإصابة جذور النباتات بالكائنات الحية الدقيقة التي تنقلها التربة
Summary
يقدم هذا البروتوكول ملخصا مفصلا لاستراتيجيات تلقيح جذور النباتات بالميكروبات التي تنقلها التربة. مثال على الفطريات Verticillium longisporum و Verticillium dahliae ، يتم وصف ثلاثة أنظمة عدوى جذرية مختلفة. يتم تسليط الضوء على التطبيقات المحتملة والتحليلات النهائية المحتملة ، وتناقش المزايا أو العيوب لكل نظام.
Abstract
يضم الريزوسفير مجتمعا ميكروبيا شديد التعقيد حيث يتم تحدي جذور النباتات باستمرار. الجذور على اتصال وثيق مع مجموعة واسعة من الكائنات الحية الدقيقة ، ولكن الدراسات حول التفاعلات التي تنقلها التربة لا تزال وراء تلك التي أجريت على الأعضاء فوق سطح الأرض. على الرغم من أن بعض استراتيجيات التلقيح لإصابة النباتات النموذجية بمسببات الأمراض الجذرية النموذجية موصوفة في الأدبيات ، إلا أنه لا يزال من الصعب الحصول على نظرة عامة منهجية شاملة. لمعالجة هذه المشكلة ، يتم وصف ثلاثة أنظمة تلقيح جذرية مختلفة بدقة يمكن تطبيقها لاكتساب رؤى ثاقبة في بيولوجيا تفاعلات الجذر والميكروبات. وللتوضيح، استخدمت أنواع Verticillium (أي V. longisporum و V . dahliae) كمسببات أمراض نموذجية غازية للجذور. ومع ذلك ، يمكن تكييف الطرق بسهولة مع الميكروبات الأخرى الاستعمارية الجذرية – المسببة للأمراض والمفيدة على حد سواء. من خلال استعمار نبات xylem ، تظهر الفطريات التي تنقلها التربة الوعائية مثل Verticillium spp. أسلوب حياة فريد. بعد غزو الجذر ، تنتشر عبر أوعية xylem acropetally ، وتصل إلى تبادل لاطلاق النار ، وتثير أعراض المرض. تم اختيار ثلاثة أنواع نباتية تمثيلية كمضيفين نموذجيين: Arabidopsis thaliana ، اغتصاب البذور الزيتية المهم اقتصاديا (Brassica napus) ، والطماطم (Solanum lycopersicum). يتم إعطاء بروتوكولات خطوة بخطوة. يتم عرض النتائج التمثيلية لاختبارات الإمراض ، والتحليلات النسخية لجينات العلامات ، والتأكيدات المستقلة بواسطة تركيبات المراسلين. علاوة على ذلك ، تتم مناقشة مزايا وعيوب كل نظام تطعيم بدقة. يمكن أن تساعد هذه البروتوكولات المثبتة في توفير مناهج لأسئلة البحث حول التفاعلات بين الجذور والميكروبات. إن معرفة كيفية تعامل النباتات مع الميكروبات في التربة أمر بالغ الأهمية لتطوير استراتيجيات جديدة لتحسين الزراعة.
Introduction
يسكن التربة الطبيعية عدد مذهل من الميكروبات التي يمكن أن تكون محايدة أو ضارة أو مفيدة للنباتات1. العديد من مسببات الأمراض النباتية تنتقل عن طريق التربة ، وتحيط بالجذور ، وتهاجم العضو تحت الأرض. تنتمي هذه الكائنات الحية الدقيقة إلى مجموعة واسعة من الكلاديس: الفطريات ، oomycetes ، البكتيريا ، الديدان الخيطية ، الحشرات ، وبعض الفيروسات 1,2. بمجرد أن تفضل الظروف البيئية العدوى ، ستصبح النباتات المعرضة للإصابة بالمرض وتنخفض غلة المحاصيل. وستؤدي آثار تغير المناخ، مثل الاحترار العالمي والظواهر الجوية المتطرفة، إلى زيادة نسبة مسببات الأمراض النباتية التي تنقلها التربة3. لذلك ، سيصبح من المهم أكثر فأكثر دراسة هذه الميكروبات المدمرة وتأثيرها على إنتاج الأغذية والأعلاف ، ولكن أيضا على النظم الإيكولوجية الطبيعية. بالإضافة إلى ذلك ، هناك تبادلات ميكروبية في التربة تتفاعل بإحكام مع الجذور وتعزز نمو النبات وتطوره ومناعته. عند مواجهة مسببات الأمراض ، يمكن للنباتات تجنيد خصوم محددين بنشاط في الريزوسفير الذي يمكن أن يدعم بقاء المضيف عن طريق قمع مسببات الأمراض4،5،6،7. ومع ذلك ، فإن التفاصيل الميكانيكية والمسارات المشاركة في التفاعلات المفيدة بين الجذر والميكروبات غالبا ما تكون غير معروفة6.
لذلك ، من الضروري توسيع الفهم العام للتفاعلات بين الجذر والميكروبات. تعد الطرق الموثوقة لتلقيح الجذور بالكائنات الحية الدقيقة التي تنقلها التربة ضرورية لإجراء دراسات نموذجية ونقل النتائج إلى التطبيقات الزراعية. تتم دراسة التفاعلات المفيدة في التربة ، على سبيل المثال ، مع Serendipita indica (المعروفة سابقا باسم Piriformospora indica) ، أو Rhizobium spp. المثبتة للنيتروجين ، أو الفطريات الفطرية ، في حين أن مسببات الأمراض النباتية المعروفة التي تنقلها التربة تشمل Ralstonia solanacearum ، Phytophthora spp. ، Fusarium spp. ، و Verticillium spp.1. الأخيران هما أجناس فطرية موزعة عالميا وتسبب أمراض الأوعية الدموية2. يمكن أن يصيب Verticillium spp. (Ascomycota) مئات الأنواع النباتية – إلى حد كبير ثنائيات الفلقة ، بما في ذلك الحولية العشبية ، والنباتات المعمرة الخشبية ، والعديد من نباتات المحاصيل 2,8. تدخل Hyphae من Verticillium الجذر وتنمو على حد سواء بين الخلايا وداخل الخلايا نحو الأسطوانة المركزية لاستعمار أوعية xylem 2,9. في هذه الأوعية ، يبقى الفطر لمعظم دورة حياته. نظرا لأن عصارة xylem فقيرة بالمغذيات وتحمل مركبات الدفاع النباتي ، يجب أن تتكيف الفطريات مع هذه البيئة الفريدة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إفراز البروتينات المرتبطة بالاستعمار التي تمكن العامل الممرض من البقاء على قيد الحياة في مضيفه10,11. بعد الوصول إلى الأوعية الدموية الجذرية ، يمكن أن ينتشر الفطر داخل أوعية xylem بشكل كبير إلى أوراق الشجر ، مما يؤدي إلى استعمار منهجي للمضيف 9,12. في هذه المرحلة ، يتأثر النبات سلبا في النمو9،10،13. على سبيل المثال ، يحدث التقزم والأوراق الصفراء وكذلك الشيخوخة المبكرة13،14،15،16.
أحد أعضاء هذا الجنس هو Verticillium longisporum ، الذي يتكيف بشكل كبير مع المضيفات النحاسية ، مثل اغتصاب البذور الزيتية المهم زراعيا ، والقرنبيط ، والنبات النموذجي Arabidopsis thaliana12. جمعت العديد من الدراسات بين V. longisporum و A. thaliana للحصول على رؤى واسعة النطاق حول أمراض الأوعية الدموية التي تنقلها التربة واستجابات الدفاع الجذري الناتجة13،15،16،17. يمكن تحقيق اختبار القابلية المباشر باستخدام نظام نموذج V. longisporum / A. thaliana والموارد الوراثية الراسخة المتاحة لكلا الكائنين. يرتبط ارتباطا وثيقا ب V. longisporum هو الممرض Verticillium dahliae. على الرغم من أن كلا النوعين الفطريين يؤديان عملية مماثلة على نمط الحياة الوعائية والغزو ، إلا أن كفاءة انتشارهما من الجذور إلى الأوراق وأعراض المرض المستحثة في A. thaliana مختلفة: في حين أن V. longisporum عادة ما يحفز الشيخوخة المبكرة ، فإن عدوى V. dahliae تؤدي إلى الذبول18. في الآونة الأخيرة ، قدم ملخص منهجي استراتيجيات تلقيح جذرية مختلفة لإصابة A. thaliana ب V. longisporum أو V. dahliae ، مما ساعد في تخطيط الإعدادات التجريبية19. في هذا المجال ، يسبب V. longisporum أحيانا أضرارا كبيرة في إنتاج اغتصاب البذور الزيتية12 ، في حين أن V. dahliae لديه مجموعة مضيفة واسعة جدا تضم العديد من الأنواع المزروعة ، مثل كرمة العنب والبطاطا والطماطم8. وهذا يجعل كلا من مسببات الأمراض نماذج مثيرة للاهتمام اقتصاديا للدراسة.
وبالتالي ، تستخدم البروتوكولات التالية كلا من V. longisporum و V. dahliae كمسببات أمراض جذرية نموذجية لتجسيد النهج الممكنة لتلقيح الجذر. تم اختيار أرابيدوبسيس (أرابيدوبسيس تاليانا)، واغتصاب البذور الزيتية (براسيكا نابوس)، والطماطم (سولانوم ليكوبيرسيكوم) كمضيفين نموذجيين. يمكن العثور على أوصاف مفصلة للمنهجيات في النص أدناه والفيديو المصاحب له. وتناقش مزايا وعيوب كل نظام تلقيح. يمكن أن تساعد مجموعة البروتوكولات هذه مجتمعة في تحديد طريقة مناسبة لأسئلة بحثية محددة في سياق التفاعلات بين الجذر والميكروبات.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظرا لخسائر الغلة الهائلة التي تسببها مسببات الأمراض النباتية التي تنقلها التربة1 ، يلزم تحسين استراتيجيات الزراعة أو أصناف المحاصيل. إن البصيرة المحدودة في التسبب في الأمراض التي تنقلها التربة تعيق تطوير نباتات أكثر مقاومة. ويلزم استكشاف الآليات المرضية الأساسية، التي تتط…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفان بتيم إيفين وجاكلين كوموريك لعملهما السابق على هذه الأساليب، ومجموعة فولفغانغ دروغ-ليزر (قسم البيولوجيا الصيدلانية، جامعة فورتسبورغ، ألمانيا) لتوفير المعدات والموارد اللازمة لهذا العمل، وفولفغانغ دروغ-ليزر وكذلك فيليب كريز (كلاهما من جامعة فورتسبورغ) للتدقيق اللغوي النقدي للمخطوطة. تم دعم هذه الدراسة من قبل “Deutsche Forschungsgemeinschaft” (DFG, DR273/15-1,2).
Materials
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | all systems described require Gelrite |
| Arabidopsis thaliana wild-type | NASC stock | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software to determine leaf areas |
| Brassica napus wild-type | see Floerl et al., 2008 | rapid-cycling rape | genome ACaacc |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | |
| Chicanery flask 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Erlenmeyer flask with four baffles |
| Collection tubes 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Czapek Dextrose Broth medium | Duchefa | C1714 | |
| Digital camera | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Desiccator ) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | Seal with lid to hold chlorine gas |
| Fluorescence Microscope | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m |
| MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Magnesiumsulfate-Heptahydrate |
| Murashige & Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS including vitamins |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Percival growth chambers | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | size ØxH: 92 × 16 mm |
| Plastic cups (500 mL, transparent) | Pro-pac, salad boxx | 5070 | size: 108 × 81 × 102 mm |
| Pleated cellulose filter | Hartenstein | FF12 | particle retention level 8–12 μm |
| poly klima growth chamber | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Potato Dextrose Broth medium | SIGMA Aldrich | P6685 | for microbiology |
| Pots | Pöppelmann GmbH | TO 7 D or TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm |
| PromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (i.e. 3xmVenus with NLS) |
| Reaction tubes 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Performance tested |
| Rotary (orbital) shaker | Edmund Bühler | SM 30 C control | |
| Sand (bird sand) | Pet Bistro, Müller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum wild-type | see Chavarro-Carrero et al., 2021 | Type: Moneymaker | |
| Thoma cell counting chamber | Marienfeld | 642710 | depth 0.020 mm; 0.0025 mm2 |
| Ultrapure water (Milli-Q purified water) | MERK | IQ 7003/7005 | water obtained after purification |
| Verticillium dahliae | see Reusche et al., 2014 | isolate JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise and von Tiedemann, 2002 | strain Vl43 |
Referenzen
- Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
- Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J. The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens. Frontiers in Plant Science. 4, 97 (2013).
- Delgado-Baquerizo, M., et al. The proportion of soil-borne pathogens increases with warming at the global scale. Nature Climate Change. 10 (6), 550-554 (2020).
- Berendsen, R. L., et al. Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium. The ISME Journal. 12 (6), 1496-1507 (2018).
- Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156 (2018).
- Liu, H., et al. Evidence for the plant recruitment of beneficial microbes to suppress soil-borne pathogens. New Phytologist. 229 (5), 2873-2885 (2021).
- Wang, H., Liu, R., You, M. P., Barbetti, M. J., Chen, Y. Pathogen biocontrol using plant growth-promoting bacteria (PGPR): role of bacterial diversity. Microorganisms. 9 (9), 1988 (2021).
- Inderbitzin, P., Subbarao, K. V. Verticillium systematics and evolution: how confusion impedes Verticillium wilt management and how to resolve it. Phytopathology. 104 (6), 564-574 (2014).
- Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlowsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum und V. dahliae with Brassica napus with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
- Floerl, S., et al. Defence reactions in the apoplastic proteome of oilseed rape (Brassica napus var. napus) attenuate Verticillium longisporum growth but not disease symptoms. BMC Plant Biology. 8, 129 (2008).
- Leonard, M., et al. Verticillium longisporum elicits media-dependent secretome responses with capacity to distinguish between plant-related environments. Frontiers in Microbiology. 11, 1876 (2020).
- Depotter, J. R. L., et al. Verticillium longisporum, the invisible threat to oilseed rape and other brassicaceous plant hosts. Molecular Plant Pathology. 17 (7), 1004-1016 (2016).
- Fröschel, C., et al. A gain-of-function screen reveals redundant ERF transcription factors providing opportunities for resistance breeding toward the vascular fungal pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1095-1109 (2019).
- Zhou, L., Hu, Q., Johansson, A., Dixelius, C. Verticillium longisporum and V. dahliae: infection and disease in Brassica napus. Plant Pathology. 55 (1), 137-144 (2006).
- Ralhan, A., et al. The vascular pathogen Verticillium longisporum requires a jasmonic acid-independent COI1 function in roots to elicit disease symptoms in Arabidopsis shoots. Plant Physiology. 159 (3), 1192-1203 (2012).
- Reusche, M., et al. Stabilization of cytokinin levels enhances Arabidopsis resistance against Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 850-860 (2013).
- Iven, T., et al. Transcriptional activation and production of tryptophan-derived secondary metabolites in Arabidopsis roots contributes to the defense against the fungal vascular pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant. 5 (6), 1389-1402 (2012).
- Reusche, M., et al. Infections with the vascular pathogens Verticillium longisporum and Verticillium dahliae induce distinct disease symptoms and differentially affect drought stress tolerance of Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 108, 23-37 (2014).
- Fröschel, C. In-depth evaluation of root infection systems using the vascular fungus Verticillium longisporum as soil-borne model pathogen. Plant Methods. 17 (1), 57 (2021).
- Karapapa, V. K., Bainbridge, B. W., Heale, J. B. Morphological and molecular characterization of Verticillium longisporum comb, nov., pathogenic to oilseed rape. Mycological Research. 101 (11), 1281-1294 (1997).
- Poncini, L., et al. In roots of Arabidopsis thaliana, the damage-associated molecular pattern AtPep1 is a stronger elicitor of immune signalling than flg22 or the chitin heptamer. PLoS One. 12 (10), 1-21 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Fradin, E. F., et al. Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1. Plant Physiology. 150 (1), 320-332 (2009).
- Singh, S., et al. The plant host Brassica napus induces in the pathogen Verticillium longisporum the expression of functional catalase peroxidase which is required for the late phase of disease. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (4), 569-581 (2012).
- Zeise, K., von Tiedemann, A. Application of RAPD-PCR for virulence type analysis within Verticillium dahliae and Verticillium longisporum. Journal of Phytopathology. 150 (10), 557-563 (2002).
- Fröschel, C., et al. Plant roots employ cell-layer-specific programs to respond to pathogenic and beneficial microbes. Cell Host & Microbe. 29 (2), 299-310 (2021).
- Gigolashvili, T., et al. The transcription factor HIG1/MYB51 regulates indolic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 50 (5), 886-901 (2007).
- Back, M. A., Haydock, P. P. J., Jenkinson, P. Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens. Plant Pathology. 51 (6), 683-697 (2002).
- Behrens, F. H., et al. Suppression of abscisic acid biosynthesis at the early infection stage of Verticillium longisporum in oilseed rape (Brassica napus). Molecular Plant Pathology. 20 (12), 1645-1661 (2019).
- Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing causality: opportunities of synthetic communities for plant microbiome research. Cell Host & Microbe. 22 (2), 142-155 (2017).
