Visualización simultánea de la dinámica de microtúbulos reticulados y únicos in vitro mediante microscopía TIRF
Summary
Aquí, se presenta un ensayo de reconstitución in vitro basado en microscopía TIRF para cuantificar y comparar simultáneamente la dinámica de dos poblaciones de microtúbulos. Se describe un método para ver simultáneamente la actividad colectiva de múltiples proteínas asociadas a microtúbulos en haces de microtúbulos reticulados y microtúbulos individuales.
Abstract
Los microtúbulos son polímeros de heterodímeros de αβ-tubulina que se organizan en estructuras distintas en las células. Las arquitecturas y redes basadas en microtúbulos a menudo contienen subconjuntos de matrices de microtúbulos que difieren en sus propiedades dinámicas. Por ejemplo, en las células en división, los haces estables de microtúbulos reticulados coexisten muy cerca de los microtúbulos dinámicos no reticulados. Los estudios de reconstitución in vitro basados en microscopía TIRF permiten la visualización simultánea de la dinámica de estas diferentes matrices de microtúbulos. En este ensayo, se ensambla una cámara de imágenes con microtúbulos inmovilizados en la superficie, que están presentes como filamentos individuales u organizados en haces reticulados. La introducción de tubulina, nucleótidos y reguladores de proteínas permite la visualización directa de proteínas asociadas y de las propiedades dinámicas de microtúbulos simples y reticulados. Además, los cambios que ocurren a medida que los microtúbulos individuales dinámicos se organizan en haces se pueden monitorear en tiempo real. El método descrito aquí permite una evaluación sistemática de la actividad y localización de proteínas individuales, así como los efectos sinérgicos de los reguladores de proteínas en dos subconjuntos de microtúbulos diferentes en condiciones experimentales idénticas, proporcionando así información mecanicista que es inaccesible por otros métodos.
Introduction
Los microtúbulos son biopolímeros que forman andamios estructurales esenciales para múltiples procesos celulares, que van desde el transporte intracelular y el posicionamiento de orgánulos hasta la división celular y el alargamiento. Para ejecutar estas diversas funciones, los microtúbulos individuales se organizan en matrices del tamaño de micras, como husos mitóticos, axonemas ciliares, haces neuronales, matrices interfase y matrices corticales de plantas. Un motivo arquitectónico omnipresente que se encuentra en estas estructuras es un haz de microtúbulos reticulados a lo largo de sus longitudes1. Una característica intrigante de varias estructuras basadas en microtúbulos es la coexistencia de microtúbulos agrupados y microtúbulos individuales no reticulados en estrecha proximidad espacial. Estas subpoblaciones de microtúbulos pueden mostrar una dinámica de polimerización marcadamente diferente entre sí, según sea necesario para su correcto funcionamiento2,3,4,5. Por ejemplo, dentro del huso mitótico, haces reticulados estables y microtúbulos individuales dinámicos están presentes dentro de una región a escala de micras en el centro celular6. Estudiar cómo se especifican las propiedades dinámicas de las poblaciones coexistentes de microtúbulos es, por lo tanto, fundamental para comprender el ensamblaje y la función de las estructuras basadas en microtúbulos.
Los microtúbulos son polímeros dinámicos que circulan entre las fases de polimerización y despolimerización, cambiando entre las dos fases en eventos conocidos como catástrofe y rescate7. La dinámica de los microtúbulos celulares está regulada por una miríada de proteínas asociadas a microtúbulos (MAP) que modulan las tasas de polimerización y despolimerización de microtúbulos y las frecuencias de catástrofes y eventos de rescate. Es difícil investigar la actividad de los MAP en matrices espacialmente proximales en células, debido a las limitaciones de la resolución espacial en microscopía de luz, especialmente en regiones de alta densidad de microtúbulos. Además, la presencia de múltiples MAP en la misma región celular dificulta las interpretaciones de los estudios biológicos celulares. Los ensayos de reconstitución in vitro, realizados junto con la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF), evitan los desafíos de examinar los mecanismos por los cuales subconjuntos específicos de MAP regulan la dinámica de las matrices de microtúbulos celulares proximales. Aquí, la dinámica de los microtúbulos ensamblados in vitro se examina en presencia de uno o más MAP recombinantes en condiciones controladas8,9,10. Sin embargo, los ensayos de reconstitución convencionales se realizan típicamente en microtúbulos individuales o en un tipo de matriz, lo que impide la visualización de poblaciones coexistentes.
Aquí, presentamos ensayos de reconstitución in vitro que permiten la visualización simultánea de dos poblaciones de microtúbulos en las mismas condiciones de solución11. Describimos un método para ver simultáneamente la actividad colectiva de múltiples MAP en microtúbulos individuales y en haces de microtúbulos reticulados por la proteína PRC1 asociada al huso mitótico. La proteína PRC1 se une preferentemente a la superposición entre microtúbulos antiparalelos, reticulándolos9. Brevemente, este protocolo consta de los siguientes pasos: (i) preparación de soluciones madre y reactivos, (ii) limpieza y tratamiento superficial de los cubrebocas utilizados para crear la cámara de imágenes para experimentos de microscopía, (iii) preparación de “semillas” de microtúbulos estables a partir de las cuales se inicia la polimerización durante el experimento, (iv) especificación de los ajustes del microscopio TIRF para visualizar la dinámica de los microtúbulos, (v) inmovilización de semillas de microtúbulos y generación de haces de microtúbulos reticulados en la cámara de imágenes, y (vi) visualización de la dinámica de microtúbulos en la cámara de imágenes a través de microscopía TIRF, tras la adición de tubulina soluble, MAP y nucleótidos. Estos ensayos permiten la evaluación cualitativa y el examen cuantitativo de la localización de MAP y su efecto en la dinámica de dos poblaciones de microtúbulos. Además, facilitan la evaluación de los efectos sinérgicos de múltiples MAP en estas poblaciones de microtúbulos, a través de una amplia gama de condiciones experimentales.
Protocol
Representative Results
Discussion
El experimento descrito aquí amplía significativamente el alcance y la complejidad de los ensayos convencionales de reconstitución de microtúbulos, que tradicionalmente se realizan en microtúbulos individuales o en un tipo de matriz. El ensayo actual proporciona un método para cuantificar y comparar simultáneamente la actividad reguladora de MAP en dos poblaciones, a saber, microtúbulos individuales y haces reticulados. Además, este ensayo permite el examen de dos tipos de haces: los que están preformados a par…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención de los NIH (no. 1DP2GM126894-01), y por fondos de Pew Charitable Trusts y Smith Family Foundation a R.S. Los autores agradecen al Dr. Shuo Jiang por su contribución al desarrollo y optimización de los protocolos.
Materials
| (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma Aldrich | 238813 | |
| 1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma Aldrich | P6757 | |
| 18×18 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63787 | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | M-6250 | |
| 24×60 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| 405/488/560/647 nm Laser Quad Band | Chroma | TRF89901-NK | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 320110 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma Aldrich | A7699-5G | |
| Avidin, NeutrAvidin® Biotin-binding Protein (Molecular Probes®) | Thermo Fischer Scientific | A2666 | |
| Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner | Branson | CPX2800H | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343778 | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343776 | |
| Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | Laysan Bio | #Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 2905 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V | Corning | 6670 | |
| Delicate Task Wipes | Kimtech | 34120 | |
| Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT10 | |
| Emission filter | Chroma | ET610/75m | |
| Ethanol (200-proof) | Decon Labs | 2705 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 3777 | |
| Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | G2133 | |
| GMPCPP | Jena Bioscience | NU-405 | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma Aldrich | G8877 | |
| Hellmanex III detergent | Sigma Aldrich | Z805939 | |
| Immersion oil, Type A | Fisher Scientific | 77010 | |
| Kappa-casein | Sigma Aldrich | C0406 | |
| Lanolin | Fisher Scientific | S25376 | |
| Lens Cleaning Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Methylcellulose | Sigma Aldrich | M0512 | |
| Microfuge 16 Benchtop Centrifuge | Beckman-Coulter | A46474 | |
| Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90° Ground Edges, WHITE Frosted | Globe Scientific | 1380-50W | |
| mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 | Laysan Bio | #NH2-PEG-VA-5K | |
| Optima™ Max-XP Tabletop Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | 393315 | |
| Paraffin | Fisher Scientific | P31-500 | |
| PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers | Ted Pella | 5377-NM | |
| Petrolatum, White | Fisher Scientific | 18-605-050 | |
| Plasma Cleaner, 115V | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1101 | |
| Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes | USA Scientific | 2520-0000 | |
| Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP Solution, Neutral pH; 500mM | Thermo Fischer Scientific | PI-77720 | |
| TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective | Nikon | CFI Apochromat TIRF 100XC Oil | |
| TIRF microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| TLA 120.1 rotor | Beckman-Coulter | 362224 | |
| TLA 120.2 rotor | Beckman-Coulter | 357656 | |
| Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton | T240 | |
| Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain | Cytoskeleton | T333P | |
| Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain | Cytoskeleton | TL670M | |
| Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain | Cytoskeleton | TL620M | |
| VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion | Vector Biolabs | SP-1800-7 | |
| VWR® Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A | VWR | 97025-630 | |
Referenzen
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