ここでは、線虫 Caenorhabditis elegansにおけるタンパク質凝集動態の解析のための方法を提示する。年齢同期された集団の動物は、異なる時点で画像化され、続いてCellProfilerで半自動包接カウントが行われ、AmyloFitの数学的モデルに適合します。
不溶性封入体へのタンパク質凝集は、様々なヒト疾患の特徴であり、その多くは加齢に関連している。線虫 Caenorhabditis elegans は、タンパク質凝集および毒性を研究するために現場で広く使用されている十分に確立されたモデル生物である。その光透過性は、蛍光顕微鏡によるタンパク質凝集の直接可視化を可能にする。さらに、速い生殖サイクルと短い寿命により、線虫はこのプロセスを調節する遺伝子や分子をスクリーニングするのに適したモデルになります。
しかしながら、生きている動物における凝集体負荷の定量は、あまり標準化されておらず、典型的には、単一の時点で蛍光解剖顕微鏡下で手動包接計数によって行われる。このアプローチでは、オブザーバー間のばらつきが大きくなり、集計プロセスの理解が制限される可能性があります。対照的に、 インビトロでの アミロイド様タンパク質凝集は、チオフラビンT蛍光によって高度に定量的かつ時間分解された様式で日常的にモニターされる。
ここでは、カスタムメイドの画像解析とデータフィッティングを組み合わせたハイスループット共焦点顕微鏡を使用して、生きている C. elegansにおける凝集動力学の偏りのない解析のために同様の方法を提示する。この方法の適用可能性は、体壁筋細胞における蛍光標識ポリグルタミン(polyQ)タンパク質の包接形成をモニタリングすることによって実証される。画像解析ワークフローは、個々の筋肉細胞における独立した核生成事象に基づく数学的モデルに適合される異なる時点での封入物の数の決定を可能にする。ここに記載される方法は、生きている動物におけるタンパク質凝集疾患に対するタンパク質分解因子および潜在的な治療法の効果を堅牢かつ定量的な方法で評価するのに有用であることが証明され得る。
ミスフォールディングされたタンパク質の不溶性沈着物への蓄積は、広範囲の疾患で起こる。よく知られている例は、アルツハイマー病におけるアミロイドβおよびタウの凝集、パーキンソン病におけるα-シヌクレイン、およびハンチントン病における拡張polyQを有するハンチンチン1,2である。これらのポリペプチドのアミロイド線維へのミスフォールディングは、依然としてほとんど不明であるメカニズムによる毒性および細胞死と関連している。アミロイド形成のメカニズムを解明することは、現在利用できない効果的な治療法を開発する上で極めて重要です。
チオフラビンT蛍光測定に基づいてアミロイド形成の詳細な調査がin vitroで行われており、凝集プロセスおよび阻害分子の効果の機構的理解につながっている3、4、5。しかし、同じ凝集機構が生細胞や生物の複雑な環境にも当てはまるかどうかは明らかではない。線虫Caenorhabditis elegansは、インビボでのタンパク質凝集を研究するのに好適なモデル生物である。それは比較的単純な解剖学を持っていますが、筋肉、腸、神経系を含む複数の組織で構成されています。それは遺伝的によく特徴付けられており、遺伝子組み換えのためのツールは容易に入手可能である。さらに、それは〜3日の短い生成時間と2〜3週間の総寿命を有する。そのため、タンパク質凝集は、実験的に都合のよい時間スケールで動物の寿命にわたって調べることができる。最後に、線虫は光学的に透明であり、生きている動物における蛍光標識タンパク質の凝集の追跡を可能にする。
C. elegansのこれらの特徴は、ハンチントンおよび他のpolyQ拡張疾患のモデルとしてのpolyQタンパク質の凝集を調べるために以前に利用されてきた。35〜40グルタミン残基の病原性閾値を超えると、黄色蛍光タンパク質(YFP)で標識されたpolyQタンパク質が、筋肉組織6、7、ニューロン8、および腸9、10において不溶性封入体を形成することが観察され得る。これらの特徴は、タンパク質凝集および毒性の遺伝子11、12、13および小分子修飾剤14についてスクリーニングするために広く使用されている。
C. elegansは 、タンパク質凝集の インビトロ 研究とマウスなどのより複雑な疾患モデルとの間のギャップを埋める上で重要な役割を果たす可能性を秘めている15。 C. elegans は薬物スクリーニング16 に順応可能であるが、最近実証されたように、 インビボでのタンパク質凝集の分子機構の基本的な理解を得るために利用することもできる17。しかし、どちらの用途でも、タンパク質凝集の定量的かつ再現性のある測定値を抽出することが最も重要です。ここでは、ハイスループットの共焦点顕微鏡と専用の画像解析パイプラインを組み合わせることでこれを実現します(図1)。
本明細書に提示される方法は、モデル生物 C. elegansにおけるタンパク質凝集動態の偏りのない定量的分析を容易にする。それは4つの重要な要素(図1)に依存する:1)線虫の年齢同期集団を維持する。2)マルチウェルプレートにおける蛍光顕微鏡;3)セルプロファイラにおける自動包接計数;4)AmyloFitのデータフィッティング。自由に動く動物や保存された画像26からの封入物の手動計数と比較して、CellProfilerでの定量化はより速く、より偏りがありません。プロトコルのもう1つの重要な進歩は、単一のタイムポイントではなく、動力学的データの取得であり、データを数学的モデルに適合させる際に集約メカニズムに定量的な洞察を提供します。
プロトコルの4つの要素は、アプリケーションに応じて変更できる独立したモジュールとして使用できます。年齢同期集団は、動物を滅菌するために5-フルオロ-2′-デオキシウリジン(FUDR)を使用して維持することもできる。この化合物は、寿命およびプロテオスタシス24,25に影響を及ぼし、実験者にとって非常に発癌性である。ただし、ワームを手動で転送することはできず、大量のワームが処理されると労働集約的になる可能性があります。他の代替手段は、子孫30を分離するための滅菌変異体29または濾過装置の使用である。
蛍光顕微鏡観察ステップは、例えば、ニューロンにおけるタンパク質凝集をモニターするためにより高い倍率を使用して調整することもできる。広視野顕微鏡は、条件間の相対的な差が封入物の絶対数よりも重要である場合に、筋細胞におけるpolyQ凝集をモニターするのに十分であり得る。このような場合でも CellProfiler パイプラインを使用できますが、ワームやインクルージョンを認識するための設定はユーザーが調整する必要があります。この技術のスループットは現在、384ウェルプレートへの動物の手動ピッキングの必要性によって制限されている。これは、マイクロ流体デバイス16の使用によって潜在的に改善され得る。アジ化ナトリウムは比較的過酷な麻酔薬であり、ヒドロゲルまたはビーズによる物理的固定化によって置き換えることができる28,29。
ここで紹介するAmyloFitでの解析は、個々の細胞における独立した核生成イベントからなる凝集メカニズムに基づいています。このモデルが適合しない場合、ユーザは、以前に開発された協調集約モデルなどの代替手段を検討するべきである17.このアプローチの限界は、異なる濃度で目的のタンパク質を発現する株が利用可能である必要があることであるが、これらは日常的な C. elegans 法24を用いて生成することができる。
全体として、このプロトコルは、 in vivo モデルシステムにおけるタンパク質凝集動態に関する高品質のデータを得る手段を提供し、凝集機構の詳細な分析を可能にする17。この方法は C.elegans 筋肉組織におけるpolyQ凝集について実証されたが、プロトコルの将来の適用は、他のタンパク質および組織ならびにプロテオスタシス因子および小分子の効果を含み得る。
The authors have nothing to disclose.
我々は、C. elegans株の森本研究室と、ハイスループット共焦点顕微鏡の支援に対するEsmeralda Bosmanに感謝する。この研究は、ユトレヒト大学からT.S.へのスタートアップ助成金によって資金提供されました。
384-well plate | Greiner | 781091 | Black with flat clear bottom |
AmyloFit | Knowles lab | v2.0 | Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk |
C. elegans Q40 line A | Morimoto lab | AM1228 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line B | Morimoto lab | AM1229 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line C | Morimoto lab | AM1230 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line D | Morimoto lab | AM1231 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
CellProfiler | Broad Institute | 4.1.3 | Downloaded from https://cellprofiler.org |
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
FIJI | Open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
High-throughput confocal microscope | Yokogawa | CellVoyager CV8000 | |
M9 buffer | Home-made | 3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4 | |
NGM plates | Home-made | 17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol | |
Pasteur pipette | WU Mainz | 250 | To make worm pick, 150 mm length |
Platinum iridium wire | Alfa Aesar | 39383 | To make worm pick, 0.25 mm diameter |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Stereomicroscope | Leica | S9 |