כאן, שיטה מוצגת לניתוח של קינטיקה הצטברות חלבון נמטודה Caenorhabditis elegans. בעלי חיים מאוכלוסייה מסונכרנת גיל הם בתמונה בנקודות זמן שונות, ואחריו ספירת הכללה חצי אוטומטית CellProfiler והתאמה למודל מתמטי באמילופיט.
הצטברות חלבונים לתכלילים בלתי מסיסים היא סימן היכר של מגוון מחלות אנושיות, שרבות מהן קשורות לגיל. אלגנס Caenorhabditis נמטודה הוא אורגניזם מודל מבוסס היטב כי כבר בשימוש נרחב בתחום כדי ללמוד צבירת חלבון ורעילות. השקיפות האופטית שלו מאפשרת הדמיה ישירה של צבירת חלבונים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. יתר על כן, מחזור הרבייה המהיר ותוחלת החיים הקצרה הופכים את הנמטודה למודל מתאים לסינון גנים ומולקולות המווסתים את התהליך הזה.
עם זאת, כימות העומס המצרפי בבעלי חיים מתוקנן בצורה גרועה, המבוצע בדרך כלל על ידי ספירת הכללה ידנית תחת מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי בנקודת זמן אחת. גישה זו יכולה לגרום לשונות גבוהה בין משקיפים ומגבילה את ההבנה של תהליך הצבירה. לעומת זאת, צבירת חלבונים דמוי עמילואיד במבחנה מנוטרת באופן שגרתי על ידי פלואורסצנטיות T thioflavin באופן כמותי מאוד ונפתר בזמן.
כאן מוצגת שיטה אנלוגית לניתוח לא משוחד של קינטיקה מצטברת ב- C. elegans החיים, תוך שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי בעל תפוקה גבוהה בשילוב עם ניתוח תמונה מותאם אישית והתאמת נתונים. הישימות של שיטה זו מודגמת על ידי ניטור היווצרות הכללה של חלבון פוליגלוטמין (polyQ) שכותרתו פלואורסצנטית בתאי השריר של דופן הגוף. זרימת העבודה של ניתוח התמונה מאפשרת לקבוע את מספר ההכללות בנקודות זמן שונות, המותאמות למודל מתמטי המבוסס על אירועי גרעין עצמאיים בתאי שריר בודדים. השיטה המתוארת כאן עשויה להיות שימושית כדי להעריך את ההשפעות של גורמי פרוטאוסטזיס וטיפולים פוטנציאליים למחלות צבירה של חלבונים בחיה חיה בצורה חזקה וכמותית.
הצטברות של חלבונים שלא טופלו בטעות לתוך מרבצים בלתי מסיסים מתרחשת במגוון רחב של מחלות. דוגמאות ידועות הן הצטברות של עמילואיד-β וטאו במחלת אלצהיימר, α-סינוקלאין במחלת פרקינסון, וציד עם polyQ מורחב במחלת הנטינגטון 1,2. הטיוח השגוי של פוליפפטידים אלה לתוך סיבי עמילואיד קשורה רעילות ומוות תאים על ידי מנגנונים שעדיין לא ברורים במידה רבה. הבהרת המנגנונים של היווצרות עמילואיד תהיה חיונית לפיתוח טיפולים יעילים, שאינם זמינים כרגע.
חקירות מפורטות של היווצרות עמילואיד בוצעו במבחנה בהתבסס על מדידות פלואורסצנטיות T thioflavin, מה שמוביל להבנה מכנית של תהליך הצבירה ואת ההשפעה של מולקולות מעכבות 3,4,5. עם זאת, לא ברור אם אותם מנגנוני צבירה נכונים בסביבה המורכבת של תאים חיים ואורגניזמים. תולעת הנמטודה Caenorhabditis elegans היא אורגניזם מודל מתאים ללמוד צבירת חלבון ב vivo. יש לו אנטומיה פשוטה יחסית אבל מורכב מרקמות מרובות, כולל שריר, מעי, ומערכת עצבים. הוא מאופיין היטב מבחינה גנטית, וכלים לשינוי גנטי זמינים. יתר על כן, יש לו זמן דור קצר של ~ 3 ימים ותוחלת חיים כוללת של 2-3 שבועות. ככזה, צבירה של חלבונים ניתן לבחון על פני תוחלת החיים של החיה על ציר זמן נוח ניסיוני. לבסוף, הנמטודה שקופה אופטית, ומאפשרת מעקב אחר צבירה של חלבונים המסומנים בפלואורסצנטיות בבעלי חיים.
תכונות אלה של C. elegans נוצלו בעבר כדי לחקור את הצטברות של חלבונים polyQ כמודל למחלות הרחבה של הנטינגטון ופוליאק אחרים. מעל הסף הפתוגניים של 35-40 שאריות גלוטמין, ניתן לראות את חלבוני הפולי-Q המסומנים בחלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) כדי ליצור תכלילים בלתי מסיסים ברקמת השריר 6,7, נוירונים8 והמעי 9,10. תכונות אלה היו בשימוש נרחב כדי לסנן עבור גנים 11,12,13 ומשלי מולקולות קטנות14 של צבירת חלבון ורעילות.
ל- C. elegans יש פוטנציאל לשחק תפקיד חשוב בגישור על הפער בין מחקרי הפריה חוץ גופית של צבירת חלבונים למודלים מורכבים יותר של מחלות כגון עכברים15. C. elegans הוא מקובל על סינון סמים16 אבל יכול גם להיות מנוצל כדי לקבל הבנה בסיסית של המנגנונים המולקולריים של צבירת חלבון ב vivo, כפי שהוכח לאחרונה17. עם זאת, עבור שני היישומים, יש חשיבות עליונה כדי לחלץ מידה כמותית לשחזור של צבירת חלבון. כאן, זה מושג באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי בעל תפוקה גבוהה בשילוב עם צינור ניתוח תמונה ייעודי (איור 1).
השיטה המוצגת במסמך זה מאפשרת ניתוח לא משוחד וכמותי של קינטיקה של צבירת חלבונים במודל אורגניזם C. elegans. זה תלוי בארבעה אלמנטים מרכזיים (איור 1): 1) שמירה על אוכלוסייה מסונכרנת גיל של נמטודות; 2) מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בלוחות multiwell; 3) ספירת הכללה אוטומטית ב- CellProfiler; 4) התאמת נתונים באמילופיט. בהשוואה לספירה ידנית של הכללות בבעלי חיים הנעים בחופשיות או מתמונות שמורות26, הכימות ב- CellProfiler הוא מהיר יותר ולא משוחד יותר. ההתקדמות העיקרית הנוספת של הפרוטוקול היא רכישת נתונים קינטיים, ולא נקודות זמן בודדות, המספקות תובנות כמותיות על מנגנון הצבירה בעת התאמת הנתונים למודל מתמטי.
ארבעת הרכיבים של הפרוטוקול יכולים לשמש כמודולים עצמאיים שניתן לשנות בהתאם ליישום. אוכלוסיות מסונכרנות גיל ניתן גם לשמור באמצעות 5-פלואורו-2′-deoxyuridine (FUDR) כדי לחטא את בעלי החיים. תרכובת זו משפיעה על תוחלת החיים ועל פרוטאוסטזיס24,25 והוא מסרטן מאוד לנסיין; עם זאת, הוא מונע העברה ידנית של התולעים, אשר יכול להיות עבודה אינטנסיבית כאשר מספרים גדולים מטופלים. חלופות אחרות הן שימוש במוטנטים סטריליים29 או מכשירי סינון כדי להפריד בין צאצאים30.
ניתן גם להתאים את שלב המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית, למשל, באמצעות הגדלות גבוהות יותר לניטור הצטברות חלבונים בתאי עצב. מיקרוסקופיה Widefield עשוי להיות מספיק כדי לפקח על צבירת polyQ בתאי שריר כאשר ההבדל היחסי בין התנאים חשוב יותר מאשר המספרים המוחלטים של תכלילים. צינור CellProfiler עדיין יכול לשמש במקרים אלה, אם כי ההגדרות לזיהוי תולעים ותכלילים יצטרכו להיות מותאמות על ידי המשתמש. התפוקה של הטכניקה מוגבלת כיום על ידי הצורך בקטיף ידני של בעלי החיים לתוך צלחת 384-well. זה יכול להיות מתוקן באופן פוטנציאלי על ידי שימוש במכשירים microfluidic16. נתרן אזיד הוא חומר הרדמה קשה יחסית, אשר יכול להיות מוחלף על ידי אימוביליזציה פיזית עם hydrogels או חרוזים 28,29.
הניתוח באמילופיט המוצג כאן מבוסס על מנגנון צבירה המורכב מאירועי התגרענות עצמאיים בתאים בודדים. במקרים בהם מודל זה אינו מתאים, על המשתמש לשקול חלופה כגון מודל הצבירה השיתופית שפותח בעבר17. מגבלה של גישה זו היא כי זנים המבטאים את החלבון של עניין בריכוזים שונים צריך להיות זמין, אם כי אלה יכולים להיווצר באמצעות שיטות שגרתיות C. elegans 24.
בסך הכל, פרוטוקול זה מספק את האמצעים להשגת נתונים באיכות גבוהה עבור קינטיקה של צבירת חלבונים במערכת מודל in vivo , ומאפשר ניתוח מפורט של מנגנוני צבירה17. למרות שהשיטה הודגמה עבור צבירה polyQ ברקמת השריר C. elegans, יישומים עתידיים של הפרוטוקול עשויים לכלול חלבונים ורקמות אחרים ואת ההשפעות של גורמי פרוטאוסטזיס ומולקולות קטנות.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים למעבדת מורימוטו על זני C. elegans ואזמרלדה בוסמן על הסיוע במיקרוסקופ הקונפוקלי בעל התפוקה הגבוהה. עבודה זו מומנה על ידי מענק סטארט-אפ מאוניברסיטת אוטרכט ל- T.S.
384-well plate | Greiner | 781091 | Black with flat clear bottom |
AmyloFit | Knowles lab | v2.0 | Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk |
C. elegans Q40 line A | Morimoto lab | AM1228 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line B | Morimoto lab | AM1229 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line C | Morimoto lab | AM1230 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line D | Morimoto lab | AM1231 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
CellProfiler | Broad Institute | 4.1.3 | Downloaded from https://cellprofiler.org |
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
FIJI | Open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
High-throughput confocal microscope | Yokogawa | CellVoyager CV8000 | |
M9 buffer | Home-made | 3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4 | |
NGM plates | Home-made | 17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol | |
Pasteur pipette | WU Mainz | 250 | To make worm pick, 150 mm length |
Platinum iridium wire | Alfa Aesar | 39383 | To make worm pick, 0.25 mm diameter |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Stereomicroscope | Leica | S9 |