Summary

Isolamento delle cellule staminali mesenchimali del tessuto adiposo di ratto per la differenziazione in cellule produttrici di insulina

Published: August 29, 2022
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Summary

Le cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (Ad-MSC) possono essere una potenziale fonte di MSC che si differenziano in cellule produttrici di insulina (IPC). In questo protocollo, forniamo passaggi dettagliati per l’isolamento e la caratterizzazione di Ad-MSC epididimali di ratto, seguiti da un protocollo semplice e breve per la generazione di IPC dallo stesso Rat Ad-MSCs.

Abstract

Le cellule staminali mesenchimali (MSC), in particolare quelle isolate dal tessuto adiposo (Ad-MSC), hanno guadagnato particolare attenzione come fonte rinnovabile e abbondante di cellule staminali che non pone alcuna preoccupazione etica. Tuttavia, i metodi attuali per isolare gli Ad-MSC non sono standardizzati e impiegano protocolli complicati che richiedono attrezzature speciali. Abbiamo isolato gli Ad-MSC dal grasso epididimale dei ratti Sprague-Dawley usando un metodo semplice e riproducibile. Le Ad-MSC isolate di solito compaiono entro 3 giorni dall’isolamento, poiché le cellule aderenti mostrano morfologia fibroblastica. Queste cellule raggiungono l’80% di confluenza entro 1 settimana dall’isolamento. Successivamente, al passaggio 3-5 (P3-5), è stata effettuata una caratterizzazione completa per le Ad-MSC isolate mediante immunofenotipizzazione per marcatori di superficie caratteristici del cluster di differenziazione MSC (CD) come CD90, CD73 e CD105, oltre a indurre la differenziazione di queste cellule lungo i lignaggi osteogenici, adipogenici e condrogeni. Questo, a sua volta, implica la multipotenza delle cellule isolate. Inoltre, abbiamo indotto la differenziazione delle Ad-MSC isolate verso il lignaggio delle cellule produttrici di insulina (IPC) attraverso un protocollo semplice e relativamente breve incorporando il mezzo Eagle modificato di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio (HG-DMEM), β-mercaptoetanolo, nicotinamide ed exendin-4. La differenziazione degli IPC è stata valutata geneticamente, in primo luogo, misurando i livelli di espressione di specifici marcatori a cellule β come MafA, NKX6.1, Pdx-1 e Ins1, nonché la colorazione del ditizone per gli IPC generati. In secondo luogo, la valutazione è stata effettuata anche funzionalmente mediante un test di secrezione di insulina stimolata dal glucosio (GSIS). In conclusione, gli Ad-MSC possono essere facilmente isolati, esibendo tutti i criteri di caratterizzazione MSC, e possono effettivamente fornire un’abbondante fonte rinnovabile di IPC in laboratorio per la ricerca sul diabete.

Introduction

Le cellule staminali mesenchimali (MSC), note anche come cellule stromali mesenchimali, sono tra i tipi di cellule più utilizzati per la medicina rigenerativa 1,2. Sono classificate come cellule staminali adulte e caratterizzate da potenziale di differenziazione multilineare e capacità di auto-rinnovamento3. Le MSC possono essere isolate e ottenute da varie fonti, tra cui tessuto adiposo, midollo osseo, sangue periferico, tessuto e sangue del cordone ombelicale, follicoli piliferi e denti 4,5.

L’isolamento delle cellule staminali dal tessuto adiposo è visto come attraente e promettente grazie al loro facile accesso, alla rapida espansione in vitro e all’alta resa6. Le cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (Ad-MSC) possono essere isolate da diverse specie come esseri umani, bovini, topi, ratti e, più recentemente, capre7. È stato dimostrato che gli Ad-MSC sono ora potenziali candidati per l’ingegneria tissutale e la terapia genica / cellulare che possono anche essere utilizzati per sviluppare un’alternativa autologa per la riparazione a lungo termine di lesioni o difetti dei tessuti molli 7,8.

L’International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) ha definito tre criteri minimi che devono essere esibiti dalle MSC per la caratterizzazione completa9. In primo luogo, devono essere aderenti alla plastica. In secondo luogo, le MSC dovrebbero esprimere marcatori di superficie delle cellule staminali mesenchimali come CD73, CD90 e CD105 e mancare di espressione dei marcatori ematopoietici CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79α o CD19 e HLA-DR. Infine, le MSC dovrebbero mostrare la capacità di differenziarsi nei tre lignaggi mesenchimali: adipociti, osteociti e condrociti. È interessante notare che le MSC possono anche differenziarsi in altri lignaggi come cellule neuronali, cardiomiociti, epatociti e cellule epiteliali 10,11.

Infatti, le MSC possiedono proprietà uniche che consentono loro di essere applicate come potenziali agenti terapeutici nella terapia rigenerativa per diverse malattie. Le MSC possono secernere fattori solubili per indurre un ambiente immunomodulatore che fornisce benefici terapeutici12. Inoltre, le MSC possono migrare verso siti di lesioni e microambienti tumorali per fornire una terapia mirata; tuttavia, i meccanismi non sono completamente chiariti13. Inoltre, le MSC hanno la capacità di secernere esosomi, vescicole extracellulari su scala nanometrica che trasportano un carico di RNA non codificanti, proteine e fattori solubili, che ultimamente sono emersi come un nuovo meccanismo del potenziale terapeutico delle MSC in varie malattie14.

Ancora più importante, le MSC hanno generato una notevole attenzione per il loro potenziale di differenziazione in cellule produttrici di insulina (IPC), sia mediante modificazione genetica15,16 o attraverso l’utilizzo di vari fattori estrinseci all’interno dei terreni di coltura in vitro17. Il periodo di induzione IPC varia notevolmente, in quanto dipende dal protocollo di induzione utilizzato e dai fattori estrinseci utilizzati. Il processo di differenziazione può durare da giorni a mesi e richiede una combinazione di fattori che inducono esogeni che devono essere aggiunti e / o ritirati in diverse fasi. Molti di questi fattori che sono stati utilizzati per il differenziamento pancreatico endocrino sono composti biologicamente attivi che hanno dimostrato di promuovere la proliferazione o differenziazione/neogenesi delle cellule β secernenti insulina e/o aumentare il contenuto di insulina delle IPC 18,19,20,21. È interessante notare qui che le MSC sono state anche segnalate per avere effetti terapeutici nel diabete e nelle sue complicanze attraverso diversi meccanismi, incluso il loro secretoma, così come una vasta gamma di azioni immuno-modulatorie 22,23,24.

In questo protocollo, presentiamo un protocollo graduale dettagliato per l’isolamento e la caratterizzazione di Ad-MSC da grasso epididimale di ratto, seguito da un protocollo semplice e relativamente breve per la generazione di IPC da Ad-MSC.

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo le linee guida approvate e tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico della Facoltà di Farmacia, The British University in Egypt (BUE), Cairo, Egitto. Il protocollo di isolamento Ad-MSC è stato adottato da Lopez e Spencer, con modifiche15. 1. Isolamento di Ad-MSC da cuscinetti di grasso epididimale di ratto Utilizzare ratti maschi Sprague-Dawley del peso di 250-300 g che non h…

Representative Results

Isolamento e caratterizzazione di Ad-MSCCome mostrato nella Figura 2, le cellule isolate dal tessuto adiposo hanno mostrato una popolazione eterogenea di cellule arrotondate e simili ai fibroblasti a partire dal giorno successivo di isolamento (Figura 2A). 4 giorni dopo l’isolamento, le cellule dei fibroblasti hanno iniziato ad aumentare in numero e dimensioni e a crescere come popolazione omogenea entro il passaggio 1 (…

Discussion

In questo protocollo, siamo riusciti a presentare un protocollo dettagliato per l’isolamento di Ad-MSC dal grasso epididimale di ratto e la differenziazione di questi Ad-MSC in IPC. Infatti, il grasso epididico di ratto è una fonte facilmente raggiungibile di tessuto adiposo per ottenere Ad-MSC e non richiede alcuna attrezzatura speciale, né per la raccolta né per la lavorazione 15,26,27. Gli Ad-MSC isolati hanno mostrato un’…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Riconosciamo il Dr. Rawda Samir Mohamed, MSc, Specialista Veterinario, Facoltà di Farmacia, Università Britannica d’Egitto (BUE) per aver aiutato con la dissezione dei ratti.

Vorremmo anche riconoscere e apprezzare gli sforzi della Facoltà di Comunicazione di Massa, The British University in Egypt (BUE) per la produzione e l’editing del video di questo manoscritto.

Vorremmo ringraziare Miss Fatma Masoud, MSc, Assistant Lecturer of English, The British University in Egypt (BUE) per la revisione e la correzione di bozze in lingua inglese del manoscritto.

Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal Center for Drug Research and Development (CDRD), Facoltà di Farmacia, The British University in Egypt (BUE), Cairo, Egitto.

Materials

Albumin, bovine serum Fraction V MP Biomedicals
Alcian Blue 8GX Sigma-Aldrich, USA A3157
Alizarin Red S Sigma-Aldrich, USA A5533
Ammonium hydroxide Fisher Scientific, Germany
Antibody for Rat CD90, FITC Stem Cell Technologies 60024FI
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A3912
Calcium Chloride Fisher Scientific, Germany
CD105 Monoclonal Antibody, FITC Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA MA1-19594
CD34 Polyclonal Antibody Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA PA5-85917
Chloroform Fisher Scientific, USA
Collagenase type I, powder Gibco, Thermo Fisher, USA 17018029
D-Glucose anhydrous, extra pure Fisher Scientific, Germany G/0450/53
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific, Germany BP231-100
Dithizone staining Sigma-Aldrich, USA D5130
DMEM – High Glucose 4.5 g/L Lonza, Switzerland 12-604F
DMEM – Low Glucose 1 g/L Lonza, Switzerland 12-707F
DMEM/F12 medium Lonza, Switzerland BE12-719F
DNAse/RNAse free water Gibco Thermo Fisher, USA 10977-035
Ethanol absolute, Molecular biology grade Sigma-Aldrich, Germany 24103
Exendin-4 Sigma-Aldrich, Germany E7144
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco Thermo Fisher, Brazil 10270-106
Formaldehyde 37% Fisher Scientific
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific, Germany
Isopropanol, Molecular biology grade Fisher Scientific, USA BP2618500
L-Glutamine Gibco Thermo Fisher, USA 25030-024
Magnesium Chloride (Anhydrous) Fisher Scientific, Germany
Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit R&D systems Inc., MN, USA SC006
Nicotinamide Sigma-Aldrich, Germany N0636
Oil Red Stain Sigma-Aldrich, USA O0625
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin Gibco Thermo Fisher, USA 15240062
Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg Lonza, Switzerland BE17-516F
Potassium Chloride Fisher Scientific, Germany
Rat Insulin ELISA Kit Cloud-Clone Corp., USA CEA682Ra
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific, Germany
Sodium Chloride Fisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) Fisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) Fisher Scientific, Germany
SYBR Green Maxima Thermo Scientific, USA K0221
Syringe filter, 0.2 micron Corning, USA 431224
TRIzol Thermo Scientific, USA 15596026
Trypan blue Gibco Thermo Fisher, USA 15250061
Trypsin-Versene-EDTA, 1X Lonza, Switzerland CC-5012
Verso cDNA synthesis kit Thermo Scientific, USA AB-1453/A
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Germany M3148

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Kassem, D. H., Habib, S. A., Badr, O. I., Kamal, M. M. Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells. J. Vis. Exp. (186), e63348, doi:10.3791/63348 (2022).

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