JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Entwicklungsbiologie

Adipositle İlişkili Bozuklukları İncelemek için İnsan iPSC'lerinin Saf Bir Adiposit Popülasyonuna Sağlam Farklılaşması

Published: February 09, 2022
doi:
10.3791/63311
, ,
1Diabetes Research Center, Qatar Biomedical Research Institute (QBRI),Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation (QF), 2College of Health and Life Sciences,Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation

Summary

Protokol, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC’ler) saf bir adiposit popülasyonunun üretilmesine izin verir. Retinoik asit, iPSC’leri adiposit üretmek için kullanılan mezenkimal kök hücrelere (MSC’ler) ayırmak için kullanılır. Daha sonra, saf adipositler elde etmek için Nil kırmızısı boyamaya dayalı bir sıralama yaklaşımı kullanılır.

Abstract

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisindeki son gelişmeler, adipositler de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinin üretilmesine izin vermiştir. Bununla birlikte, mevcut farklılaşma yöntemleri düşük verimliliğe sahiptir ve homojen bir adiposit popülasyonu üretmemektedir. Burada, mezenkimal kök hücreleri (MSC’ler) yüksek verimde üretmek için all-trans retinoik bazlı bir yöntem kullanarak bu sorunu aşıyoruz. Hücre proliferasyonunu, hayatta kalmayı ve yapışmayı yöneten yolları düzenleyerek, farklılaşma stratejimiz, saf bir multipotent MSC popülasyonuna farklılaşan embriyonik cisimlerin (EB’ler) verimli bir şekilde üretilmesini sağlar. Bu yöntemle üretilen yüksek sayıda MSC, adiposit üretmek için ideal bir kaynak sağlar. Bununla birlikte, adiposit farklılaşmasından kaynaklanan örnek heterojenliği bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, FACS kullanarak lipit taşıyan olgun adipositleri saflaştırmak için Nil kırmızısı bazlı bir yöntem kullandık. Bu sıralama stratejisi, adipositle ilişkili metabolik bozuklukları, azaltılmış numune heterojenliği ve gelişmiş hücre işlevselliği ile bir adiposit havuzu kullanarak modellemek için güvenilir bir yol oluşturmamızı sağladı.

Introduction

Mezenkimal kök hücreler (MSC’ler), adipositler, osteositler ve kondrositler gibi mezodermal kökenli hücrelerin üretilmesi için etkili bir geçici kaynak görevi görür ve bu hücreler kendi genetik bozukluklarını modellemek için daha fazla kullanılabilir. Bununla birlikte, önceki yaklaşımlar, bu MSC’lerin yetişkin dokulardan elde edilmesine dayanıyordu 1, bu da onları donörlerden yüksek sayılarda elde etme zorluğunu ve onları suboptimal in vitro kültür koşullarında işlevsel olarak canlı tutmanın sınırlandırılmasını getirdi 1,2. Bu engeller, in vitro MSC’ler üretmek için bir protokole sahip olma konusunda büyük bir talep yaratmıştır. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSC’ler), MSC özelliklerini sergileyen değerli bir MSC kaynağı olarak kullanılabilir 3,4,5. iPSC’lerden türetilen MSC’ler çeşitli hastalıklarda terapötik bir seçenek olarak kullanılabilir. Ayrıca, iPSC’lerden türetilen MSC’lerin adiposit üretme yeteneği, onları insan adipogenezi, obezite ve adiposit ile ilişkili bozuklukları incelemek için değerli bir in vitro insan modeli haline getirir.

Adipositlerin mevcut farklılaşma protokolleri iki gruba ayrılabilir, bunlardan biri kimyasal veya protein bazlı kokteyller kullanılarak adipositlerin farklılaştırılmasını içerir ve sonuçta %30-%60 oranında 6,7,8,9 verim sağlarken, diğeri %80-%90 verim vermek üzere adipositlerin gelişimini yöneten anahtar transkripsiyon faktörlerinin sağlam indüksiyonu için genetik manipülasyonu içerir. 11. Bununla birlikte, genetik manipülasyon, adiposit farklılaşmasının doğal sürecini özetlemez ve genellikle adipogenez sırasında gelen ince paradigmaları maskeler, bu da hastalık modelleme amaçları için etkisiz hale getirir12,13. Bu nedenle, Nil kırmızısı kullanarak lipit taşıyan adipositleri floresan olarak etiketleyerek kimyasal olarak türetilmiş olgun adipositleri olgunlaşmamış olanlardan ayırmanın bir yolunu sunuyoruz.

Burada, iPSC’lerden türetilmiş embriyoid cisimlerin (EB’ler) all-trans retinoik asit ile geçici inkübasyonunu içeren bir protokol sunuyoruz ve bu da adipositlerin14 üretilmesinde daha fazla kullanılabilecek çok sayıda hızla çoğalan MSC’ler üretiyor. Ayrıca, kimyasal olarak türetilmiş olgun adipositleri, lipofilik bir boya kullanarak lipit damlacıklarını floresan olarak etiketleyerek heterojen farklılaşma havuzundan ayırmanın bir yolunu sunuyoruz; Nil kırmızısı. Bu, adipositle ilişkili metabolik bozuklukları doğru bir şekilde modellemek için gelişmiş işlevselliğe sahip saf bir olgun adiposit popülasyonunun oluşturulmasına izin verecektir.

Protocol

Çalışma, ilgili kurumsal araştırma etik komitesi tarafından onaylanmış ve 1964 Helsinki Deklarasyonu’nda ve daha sonraki değişikliklerinde veya karşılaştırılabilir etik standartlarda belirtilen etik standartlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokol, HMC (no. 16260/16) ve QBRI (no. 2016-003) Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışma aynı zamanda H1 ve H9 gibi hESC’ler için de optimize edilmiştir. Sağlıklı bireylerden tam bilgilendirilmiş onam alınarak kan …

Representative Results

Mezenkimal farklılaşma sırasında hücrelerin şematik ve morfolojisi: iPSC’lerin MSC’lere farklılaşması, EB oluşumu, MSC farklılaşması ve MSC genişlemesi boyunca uzanan çeşitli gelişim aşamalarını içerir (Şekil 1). Gelişimin bu aşamalarında, hücreler maruz kaldıkları farklı uyarıcı kimyasallar nedeniyle çeşitli morfolojiler kazanırlar. Farklılaşmayı başlattıktan sonra, hücreler süspansiyonla kaplanır ve çapı küçük ila orta büyüklükte iken, tan?…

Discussion

Bu protokol, MSC’leri yüksek verim ve verimlilikte sağlama kabiliyeti nedeniyle büyük önem taşımaktadır. MSC’lerin bu kitlesel ölçekli üretimi, iPSC’lerden türetilmiş EB’lerin 10 μM RA14,15 ile geçici inkübasyonu ile mümkün olmuştur. 10 μM RA ile geçici işlem, MSC verimini 11,2 ila 1542 kat artırdı14,15, bu protokol hem iPSC’lerde hem de hPSC’lerde uygulanabilir. Bu doz ve tedavi s…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Katar Ulusal Araştırma Fonu’ndan (QNRF) bir hibe ile finanse edilmiştir (Hibe No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi Katar Ulusal Araştırma Fonu’ndan (QNRF) GSRA bursu ile desteklendi.

Materials

Adiponectin Abcam ab22554 Adipocyte maturation marker
anti-CD105 BD Pharmingen 560839 MSC differentiation marker
anti-CD14 BD Pharmingen 561712 MSC differentiation marker
anti-CD19 BD Pharmingen 555415 MSC differentiation marker
anti-CD34 BD Pharmingen 555824 MSC differentiation marker
anti-CD44 abcam ab93758 MSC differentiation marker
anti-CD45 BD Pharmingen
560975		 MSC differentiation marker
anti-CD73 BD Pharmingen 550256 MSC differentiation marker
anti-CD90 BD Pharmingen 555596 MSC differentiation marker
bFGF R&D 233-FP MSC culture media supplement
C/EBPA Abcam ab40761 Adipocyte maturation marker
Dexamethasone Torics 1126 Adipocyte differentiation media supplement
FABP4 Abcam ab93945 Adipocyte maturation marker
Fetal bovine serum ThermoFisher 10082147 MSC culture media supplement
Glutamax ThermoFisher 35050-061 MSC culture media supplement
IBMX Sigma Aldrich I5879 Adipocyte differentiation media supplement
Indomethacin Sigma Aldrich I7378 Adipocyte differentiation media supplement
Insulin Sigma Aldrich 91077C Adipocyte differentiation media supplement
Knockout DMEM ThermoFisher 12660012 Basal media for preparing matrigel
Low glucose DMEM ThermoFisher 11885084 MSC culturing media
Matrigel Corning 354230 Coating matrix
MEM-alpha ThermoFisher 12561056 Adipocyte differentiation media
Nilered Sigma Aldrich 19123 Sorting marker for adipocyte
Penicillin ThermoFisher 15140122 MSC/Adipocyte media supplement
Phosphate-buffered saline ThermoFisher 14190144 wash buffer
Pierce™ 20X TBS Buffer Thermo Fisher 28358 wash buffer
PPARG Cell Signaling Technology 2443 Adipocyte maturation marker
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872 Dissociation reagent
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625 MSC differentiation media supplement
Rock inhibitor Tocris 1254/10 hPSC culture media supplement
Roziglitazone Sigma Aldrich R2408 Adipocyte differentiation media supplement
StemFlex ThermoFisher A334901 hPSC culture media
Triton Thermo Fisher 28314 Permebealization reagent
Trypsin ThermoFisher 25200072 Dissociation reagent
Tween 20 Sigma Aldrich P7942 Wash buffer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12 (2011).
  2. Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PLoS One. 4 (6), 5846 (2009).
  3. Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow. Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).
  4. Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).
  5. Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Medicine. 2 (6), 161 (2005).
  6. Xiong, C., et al. Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).
  7. Cuaranta-Monroy, I., et al. Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid. Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).
  8. van Harmelen, V., et al. Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes. Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).
  9. Noguchi, M., et al. In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).
  10. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  11. Lee, Y. K., Cowan, C. A. Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).
  12. Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).
  13. Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
  14. Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells. Cells. 9 (3), (2020).
  15. Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. , (2020).
  16. Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).
  17. Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis. Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).
  18. Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5. FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).
  19. di Masi, A., et al. Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 41, 1 (2015).
  20. Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).
  21. De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells. Cell Death & Disease. 9 (1), 6 (2018).
  22. Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2018, 4387932 (2018).
  23. Moldes, M., et al. Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis. The Biochemical Journal. 376, 607-613 (2003).
  24. Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289 (5481), 950-953 (2000).
  25. Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).
  26. Mohsen-Kanson, T., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3. Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).
  27. Billon, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
  28. Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways. Development. 137 (3), 389-394 (2010).
  29. Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
  30. Festy, F., et al. Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes. Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).
  31. Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity. PLoS One. 7 (5), 36785 (2012).
  32. Mesuret, G., et al. A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern. Scientific Reports. 8 (1), 8536 (2018).
  33. Silverstein, R. L., Febbraio, M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Science Signaling. 2 (72), (2009).
  34. Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis. European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).
  35. Davies, A., et al. CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells. The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).
  36. Lapid, K., Graff, J. M. Form(ul)ation of adipocytes by lipids. Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).
  37. Aldridge, A., et al. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells–a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
  38. Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. A simple method to sort ESC-derived adipocytes. Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).
  39. Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).

Tags

Human IPSCsAdipocyte DifferentiationMesenchymal Stem CellsNile Red SortingMSC Differentiation MediaRetinoic AcidEmbryonic BodiesDMEM Low-glucose Medium

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Aghadi, M., Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders. J. Vis. Exp. (180), e63311, doi:10.3791/63311 (2022).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image