تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى سلائف خلايا بيتا البنكرياس في نظام ثقافة 2D
Summary
يصف البروتوكول الحالي طريقة محسنة لزيادة التعبير المشترك لعوامل النسخ PDX1 و NKX6.1 في أسلاف البنكرياس المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) في الطبقات الأحادية المستوية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تجديد المصفوفة الطازجة ، والتلاعب بكثافة الخلايا ، وفصل الخلايا الداخلية.
Abstract
الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) هي أداة ممتازة لدراسة تطور البنكرياس المبكر والتحقيق في المساهمين الوراثيين في مرض السكري. يمكن توليد الخلايا المفرزة للأنسولين المشتقة من hPSC للعلاج بالخلايا ونمذجة المرض ، مع كفاءة وخصائص وظيفية محدودة. السلف البنكرياس المشتقة من hPSC والتي هي سلائف لخلايا بيتا وخلايا الغدد الصماء الأخرى ، عندما تعبر عن عاملي النسخ PDX1 و NKX6.1 ، تحدد السلف لخلايا بيتا الوظيفية التي تفرز الأنسولين في كل من المختبر وفي الجسم الحي. تستخدم أسلاف البنكرياس المشتقة من hPSC حاليا للعلاج بالخلايا في مرضى السكري من النوع 1 كجزء من التجارب السريرية. ومع ذلك ، فإن الإجراءات الحالية لا تولد نسبة عالية من NKX6.1 وأسلاف البنكرياس ، مما يؤدي إلى التوليد المشترك لخلايا الغدد الصماء غير الوظيفية وعدد قليل من الخلايا المستجيبة للجلوكوز والتي تفرز الأنسولين. وهكذا طور هذا العمل بروتوكولا محسنا لتوليد أسلاف البنكرياس المشتقة من hPSC والتي تزيد من التعبير المشترك ل PDX1 و NKX6.1 في طبقة أحادية ثنائية الأبعاد. يتم تعديل عوامل مثل كثافة الخلايا ، وتوافر مصفوفة جديدة ، وتفكك خلايا الجلد الباطنة المشتقة من hPSC التي زادت من مستويات PDX1 و NKX6.1 في أسلاف البنكرياس المتولدة وتقليل الالتزام بالنسب الكبدي البديل. تسلط الدراسة الضوء على أن التلاعب بالبيئة المادية للخلية أثناء التمايز في المختبر يمكن أن يؤثر على مواصفات النسب والتعبير الجيني. لذلك ، يسهل البروتوكول المحسن الحالي التوليد القابل للتطوير من أسلاف التعبير المشترك PDX1 و NKX6.1 للعلاج الخلوي ونمذجة الأمراض.
Introduction
مرض السكري هو اضطراب استقلابي معقد يؤثر على ملايين الأشخاص على مستوى العالم. تعتبر مكملات الأنسولين الخيار العلاجي الوحيد لمرض السكري. يتم علاج الحالات الأكثر تقدما بالعلاج ببدائل خلايا بيتا ، والتي تتحقق من خلال زرع إما بنكرياس جثة كاملة أو جزر 1,2. تحيط العديد من القضايا بعلاج الزرع ، مثل الحد من توافر الأنسجة وجودتها ، وغزو إجراءات الزرع بالإضافة إلى الحاجة المستمرة لمثبطات المناعة. وهذا يستلزم الحاجة إلى اكتشاف خيارات جديدة وبديلة للعلاج ببدائل خلايا بيتا 2,3. ظهرت الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) مؤخرا كأداة واعدة لفهم بيولوجيا البنكرياس البشري وكمصدر غير شامل وربما أكثر تخصيصا لعلاج الزرع4،5،6،7. تتمتع hPSCs ، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) ، بقدرة عالية على التجديد الذاتي وتؤدي إلى ظهور أي نوع من أنسجة جسم الإنسان. يتم اشتقاق hESCs من كتلة الخلية الداخلية للجنين ، ويتم إعادة برمجة hiPSCs من أي خلية جسدية 4,8.
تم تحسين بروتوكولات التمايز الموجه لتوليد خلايا بيتا البنكرياس من hPSCs التي توجه hPSCs بالتتابع من خلال مراحل نمو البنكرياس في المختبر. تولد هذه البروتوكولات عضويات جزيرة مشتقة من hPSC. في حين أنها تحسنت بشكل كبير في زيادة نسبة خلايا بيتا البنكرياس فيها ، فإن كفاءة البروتوكولات متغيرة للغاية. لا يزيد إلى أكثر من ~ 40٪من خلايا NKX6.1 + / INSULIN + أو C-PEPTIDE + 5،9،10،11،12،13. ومع ذلك ، فإن خلايا بيتا المتولدة ليست متطابقة تماما مع خلايا بيتا البشرية البالغة من حيث ملامحها النسخية والأيضية واستجابتها للجلوكوز4،5،14. تفتقر خلايا بيتا المشتقة من hPSC إلى التعبير الجيني لعلامات خلايا بيتا الرئيسية مثل PCSK2 و PAX6 و UCN3 و MAFA و G6PC2 و KCNK3 مقارنة بالجزر البشرية البالغة5. بالإضافة إلى ذلك ، فإن خلايا بيتا المشتقة من hPSC قد قللت من إشارات الكالسيوم استجابة للجلوكوز. وهي ملوثة بالخلايا متعددة الهرمونات المتولدة بشكل مشترك والتي لا تفرز كميات مناسبة من الأنسولين استجابة لزيادة مستويات الجلوكوز5. من ناحية أخرى ، يمكن توليد أسلاف البنكرياس المشتقة من hPSC ، والتي هي سلائف جزرية ، بشكل أكثر كفاءة في المختبر مقارنة بخلايا بيتا ، وعند زرعها في الجسم الحي ، يمكن أن تنضج إلى خلايا بيتا وظيفية تفرز الأنسولين15,16. تركز التجارب السريرية حاليا على إثبات سلامتها وفعاليتها عند الزرع في مواضيع T1D.
والجدير بالذكر أن التعبير عن عوامل النسخ PDX1 (البنكرياس والاثني عشر Homeobox 1) و NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) داخل نفس الخلية السلفية للبنكرياس أمر بالغ الأهمية للالتزام تجاه سلالة خلية بيتا5. السلف البنكرياس التي تفشل في التعبير عن NKX6.1 تؤدي إلى خلايا الغدد الصماء متعددة الهرمونات أو خلايا بيتا غير الوظيفية17,18. لذلك ، فإن التعبير المشترك العالي ل PDX1 و NKX6.1 في مرحلة السلف البنكرياسي ضروري لتوليد عدد كبير من خلايا بيتا الوظيفية في النهاية. أظهرت الدراسات أن الجسم الجنيني أو الثقافة ثلاثية الأبعاد تعزز PDX1 و NKX6.1 في أسلاف البنكرياس حيث يتم تجميع الخلايا المتمايزة ، والتي تتراوح بين 40٪ -80٪ من سكان PDX1 + / NKX6.1 +12,19. ومع ذلك ، بالمقارنة مع ثقافات التعليق ، فإن ثقافات التمايز 2D أكثر فعالية من حيث التكلفة وممكنة وملائمة للتطبيق على خطوط خلايا متعددة5. لقد أظهرنا مؤخرا أن ثقافات التمايز أحادية الطبقة تنتج أكثر من 90٪ من أسلاف البنكرياس المشتقة من PDX1 + / NKX6.1 +20،21،22. منحت الطريقة المبلغ عنها قدرة تكرار عالية لأسلاف البنكرياس المتولدة ومنعت مواصفات المصير البديلة مثل السلالة الكبدية21. لذلك ، هنا ، يوضح هذا البروتوكول طريقة عالية الكفاءة للتمييز بين hPSCs وسلائف خلايا بيتا البنكرياسية التي تعبر عن PDX1 و NKX6.1. تستخدم هذه الطريقة تقنية فصل الأديم الباطن المشتق من hPSC والتلاعب بكثافة الخلية ، متبوعا بإشارات FGF و Retinoid الممتدة بالإضافة إلى تثبيط القنفذ لتعزيز التعبير المشترك PDX1 و NKX6.1 (الشكل 1). يمكن أن تسهل هذه الطريقة جيلا قابلا للتطوير من سلائف خلايا بيتا البنكرياسية المشتقة من hPSC لعلاج الزرع ونمذجة المرض.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا العمل بروتوكولا محسنا لتوليد أسلاف البنكرياس من hPSCs مع تعبير مشترك عالي عن PDX1 و NKX6.1. أدى تفكك وإعادة طلاء الأديم الباطن المشتق من hPSC بنصف كثافة على مصفوفة جديدة إلى ارتفاع PDX1 و NKX6.1 في أسلاف البنكرياس المشتقة من hPSC.
على الرغم من أن كوكتيل عامل النمو لكل مرحلة يشبه إلى ح?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل بمنحة من الصندوق القطري لرعاية البحث العلمي (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041).
Materials
| 15 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| 24-well culture plates, flat bottom with lid | Costar | 3524 | |
| 50 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 6- well culture plates, multidish | Thermo Scientific | 140685 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | Reconstituted in 4 mM HCl |
| Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal | DSHB | F55A12-C | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal | Abcam | ab47308 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining |
| B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstituted in DMSO |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| FGF10 | R&D | 345-FG | Reconstituted in PBS |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR serum replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Ascorbic acid (vitamin C) | Sigma | A92902 | Reconstituted in distilled water |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Aliquot the thawed stock and freeze at -20C. |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| Nalgene filter units, 0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstituted in distilled water |
| NOGGIN | R&D | 6057-NG | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Portable vacuum aspirator | |||
| Rabbit anti-FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstituted in DMSO |
| Rock inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstituted in DMSO |
| Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstituted in DMSO |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
| Tali image-based cytometer automated cell counter | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
Referenzen
- Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
- Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J. Navigating two roads to glucose normalization in diabetes: Automated insulin delivery devices and cell therapy. Cell Metabolism. 29 (3), 545-563 (2019).
- Vaithilingam, V., Tuch, B. E. Islet transplantation and encapsulation: An update on recent developments. Review of Diabetic Studies. 8 (1), 51-67 (2011).
- Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2459-2483 (2021).
- Memon, B., Abdelalim, E. M. Stem cell therapy for diabetes: Beta cells versus pancreatic progenitors. Cells. 9 (2), 283 (2020).
- Balboa, D., Iworima, D. G., Kieffer, T. J. Human pluripotent stem cells to model islet defects in diabetes. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 12, 642152 (2021).
- Gaertner, B., Carrano, A. C., Sander, M. Human stem cell models: Lessons for pancreatic development and disease. Genes & Development. 33 (21-22), 1475-1490 (2019).
- Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Nair, G. G., et al. Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells. Nature Cell Biology. 21 (2), 263-274 (2019).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
- Hrvatin, S., et al. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3038-3043 (2014).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
- Bruin, J. E., et al. Characterization of polyhormonal insulin-producing cells derived in vitro from human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 12 (1), 194-208 (2014).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Memon, B., Abdelalim, E. M. Highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Memon, B., Karam, M., Al-Khawaga, S., Abdelalim, E. M. Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 15 (2018).
- Aigha, I. I., Memon, B., Elsayed, A. K., Abdelalim, E. M. Differentiation of human pluripotent stem cells into two distinct NKX6.1 populations of pancreatic progenitors. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 83 (2018).
- Ali, G., et al. Keratinocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells recapitulate the genetic signature of psoriasis disease. Stem Cells and Development. 29 (7), 383-400 (2020).
- Elsayed, A. K., et al. Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2. Stem Cell Research. 42, 101705 (2020).
- Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling. Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).
- Schroeder, I. S., et al. Induction and selection of Sox17-expressing endoderm cells generated from murine embryonic stem cells. Cells Tissues Organs. 195 (6), 507-523 (2012).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Elsayed, A. K., Younis, I., Ali, G., Hussain, K., Abdelalim, E. M. Aberrant development of pancreatic beta cells derived from human iPSCs with FOXA2 deficiency. Cell Death & Disease. 12 (1), 103 (2021).
- Mfopou, J. K., Chen, B., Mateizel, I., Sermon, K., Bouwens, L. Noggin, retinoids, and fibroblast growth factor regulate hepatic or pancreatic fate of human embryonic stem cells. Gastroenterology. 138 (7), 1-14 (2010).
- Mfopou, J. K., De Groote, V., Xu, X., Heimberg, H., Bouwens, L. Sonic hedgehog and other soluble factors from differentiating embryoid bodies inhibit pancreas development. Stem Cells. 25 (5), 1156-1165 (2007).
- Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
- Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
- Shih, H. P., Panlasigui, D., Cirulli, V., Sander, M. ECM signaling regulates collective cellular dynamics to control pancreas branching morphogenesis. Cell Reports. 14 (2), 169-179 (2016).
- Raza, A., Ki, C. S., Lin, C. C. The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D. Biomaterials. 34 (21), 5117-5127 (2013).
- Lin, H. Y., et al. Fibronectin and laminin promote differentiation of human mesenchymal stem cells into insulin producing cells through activating Akt and ERK. Journal of Biomedical Science. 17, 56 (2010).
- Boretti, M. I., Gooch, K. J. Effect of extracellular matrix and 3D morphogenesis on islet hormone gene expression by Ngn3-infected mouse pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering Part A. 14 (12), 1927-1937 (2008).
- Boretti, M. I., Gooch, K. J. Induced cell clustering enhances islet beta cell formation from human cultures enriched for pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering. 12 (4), 939-948 (2006).
- Beattie, G. M., Rubin, J. S., Mally, M. I., Otonkoski, T., Hayek, A. Regulation of proliferation and differentiation of human fetal pancreatic islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cell-cell contact. Diabetes. 45 (9), 1223-1228 (1996).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), 82076 (2013).
