בידוד תאי אנדותל ריאה ראשוניים של עכבר

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו. במחקר נעשה שימוש בגורים זכרים מסוג C57BL/6 neonatal mouse pups (גילאי 5-7 ימים). הפרוטוקול כולו אורך 7-10 ימים (איור 1). 1. הכנת תווך תאי אנדותל הכינו את המדיום הבסיסי: מדיום הנשר המעובד של דולבקו עם 4,500 מ”ג/ליטר גלוקוז ו-4 מ”מ L-גלוטמין (DMEM) בתוספת 20% (v/v) נסיוב בקר עוברי מומת חום, 100 U/100 מיקרוגרם/מ”ל פניצילין/סטרפטומיצין ו-25 מ”מ HEPES (ראו טבלת חומרים). מסנן סטרילי עם מסנן 22 מיקרומטר. יש לאחסן את המדיום הבסיסי בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש בו תוך חודש מההכנה. הכן את המדיום המלא: מדיום בסיסי בתוספת 100 מיקרוגרם / מ”ל של הפרין, 100 מיקרוגרם / מ”ל של תוסף צמיחת תאי אנדותל, 1x חומצות אמינו לא חיוניות, ו 1 mM נתרן פירובט (ראה טבלה של חומרים). מסנן סטרילי עם מסנן 22 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש תוך חודש מההכנה. 2. ציפוי מקדים של חרוזים מגנטיים נגד חולדות13 ייצור 50 מ”ל של חיץ לשטיפת חרוזים: תמיסה חוצצת פוספט (PBS) בתוספת אלבומין בסרום בקר (BSA) 0.1% (w/v). מסנן סטרילי עם מסנן 22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 ° C ולהשתמש בתוך חודש של הכנה. מערבבים את החרוזים המגנטיים למשך מספר שניות כדי להשהות מחדש את החרוזים והפיפטה 50 μL של החרוזים (2 x 107 חרוזים) לשני צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ”ל, אחד עבור CD-31 ואחד עבור CD-102 (ראה רשימת חומרים). מוסיפים 1 מ”ל של חיץ שטיפת חרוזים ומערבבים היטב.הערה: כל הכרכים שהוזכרו שימשו לבידוד תאי אנדותל מ-3-4 גורי עכברים ילודים (בני 5-7 ימים). CD-31 ו-CD-102 הם סמני פני השטח של תאי אנדותל המשמשים לבחירת חרוזים חיסוניים מגנטיים. מניחים את הצינורות על מפריד מגנטי ומסירים את הסופרנאטנט בעזרת פיפט פסטר זכוכית. יש לחזור על השטיפה 3 פעמים עם 1 מ”ל של חיץ שטיפת חרוזים בכל פעם. יש להשהות חרוזים בנפח חרוזים מקורי, 50 μL, עם חיץ לשטיפת חרוזים. לאחר מכן הוסף 5 μL (2.5 מיקרוגרם) של נוגדן (CD-31/CD-102) לכל 50 μL של חרוזים. יש לדגור על מתלי חרוזים בסיבוב עדין על מסובב מקצה לקצה למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C או למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר. יש לחזור על הכביסה 4 פעמים. יש להשהות מחדש את ה-immunobeads בנפח המקורי, 50 μL, עם מאגר שטיפת חרוזים ולאחסן בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש תוך 1-2 שבועות. 3. בידוד וציפוי של תאי הריאה הכינו תמיסת קולגנאז מסוג 1 ביום הבידוד: הוסיפו 25 מ”ג של collagenase מסוג 1 ל-25 מ”ל HBSS (ראו טבלת חומרים). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת עם סיבוב עדין ומסנן סטרילי באמצעות מסנן 22 מיקרומטר. יש לחמם את התמיסה בטמפרטורה של 37°C. הזריקו לגורי עכברים בני 5-7 ימים תוך שרירית עם הפרין (25 μL/עכבר, 1,000 U/mL) 10 דקות לפני המתת חסד כדי למזער את הפעלת תאי האנדותל ואת היווצרות הקריש14,15. הרדימו את גור העכבר באמצעות עריפת ראש באמצעות מספריים חדים בהתאם להנחיות AVMA לשנת 2020 להמתת חסד. לאחר מכן, הצמד את העכבר ללוח דיסקציה עם צד הגחון כלפי מעלה. רססו את הפגר באתנול 70%, ואז חשפו את חלל בית החזה על ידי חיתוך הסרעפת תחילה ולאחר מכן חיתוך עליון כלפי מעלה לאורך כל הקירות הרוחביים של החזה. החזרת כלוב הצלעות אז חושפת את הלב והריאות.הערה: השתמש במלקחיים ומספריים קטנים יותר עבור שלב זה בהתחשב בגודל הקטן של עכברים ילודים, וודא לא לחדור את הלב או הריאות כמו זה יוביל להסרת דם מספקת מן הריאות. חבר מחט 25 גרם למזרק 10 מ”ל, והזריק 5 מ”ל DMEM קר לחדר הימני של הלב כדי להסיר דם מהריאות. הריאות יהפכו ללבנות. הסר את הריאות מחלל בית החזה, אונה אחת בכל פעם, על ידי חיתוך האונות הדיסטליות לסמפונות המתאימות. אגרו את כל אונות הריאה לתוך צינור חרוטי של 50 מ”ל ממולא מראש ב-20 מ”ל של מדיום בזאלי קר כקרח (משלב 1.1). חזור על שלבים 3.2-3.7 עם גורי העכבר האחרים, תוך איגום כל אונות הריאה לאותו צינור חרוטי של 50 מ”ל. בעדינות לעורר את הצינור ביד במשך 10-15 שניות כדי לשטוף כל עודף תאי דם אדומים מוערך חזותית על פני השטח של הריאות.הערה: אין צורך להסיר את כל הדם מתוך או סביב הריאות; עם זאת, זה משפר את הטוהר. כל טיפול נוסף ברקמות צריך להיעשות במכסה מנוע סטרילי. השתמשו במסננת תאים כדי להסיר את הריאות מהתקשורת, והעבירו את הרקמה לצלחת תרבית רקמה סטרילית חד פעמית בקוטר 100 מ”מ וטחנו במספריים מעוקרים. מעבירים את הרקמה הטחונה לצינור החרוטי 50 מ”ל עם 25 מ”ל של תמיסת קולגנאז מחוממת מראש (שלב 3.1). מערבבים בעדינות על מיקסר מסתובב במשך 45 דקות ב-37°C.הערה: עיכול יתר אפילו במשך 60 דקות יכול להוביל לתפוקות נמוכות יותר. חברו מזרק בנפח 20 מ”ל לצינורית קהה במשקל 15 גרם (ראו טבלת חומרים) ושלשו את התרחיף 10-15 פעמים כדי לפרק את הרקמה לתרחיף תאי. היו נמרצים, אך הימנעו מהקצפה מוגזמת.הערה: לא יהיו עוד חתיכות נראות לעין של הריאה, ובמקום זאת, המתלה יהיה מעונן עם השלמת שלב זה. סנן את המתלה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי טרי של 50 מ”ל. יתר על כן, לשטוף את הצינור החרוטי המשמש לעיכול ואת מסננת התא עם 15 מ”ל נוספים של מדיום בסיסי. צנטריפוגה את המתלה התאי ב 400 x גרם במשך 8 דקות ב 4 ° C. מוציאים את supernatant עם צינור פסטר זכוכית לתלות מחדש את הגלולה ב 2 מ”ל של מדיום שלם. מעבירים לבקבוק T-75 ומוסיפים 8 מ”ל של תרבית בינונית מלאה ב 37 ° C באינקובטור לח, 5% CO2 . למחרת, שטפו פעמיים צלוחיות עם 10 מ”ל של תמיסת המלח המאוזנת של האנק ללא סידן ומגנזיום (HBSS/CMF) (ראו טבלת חומרים) והוסיפו 10 מ”ל מדיום שלם.הערה: לאחר 2-3 ימים, התרבית תהיה 90-95% שוטפת ומוכנה לבידוד חיסוני ראשוני. 4. בידוד חיסוני ראשוני וגידול תאי אנדותל יש לשטוף תאי אנדותל דבקים פעמיים עם 10 מ”ל HBSS/CMF. הוסף 2 מ”ל של תמיסת היפרדות תאים ללא טריפסין (ראה טבלת חומרים) ודגור ב 37 ° C במשך ~ 5 דקות. ודא שכל התאים הורמו מהצלוחית.הערה: יש להשתמש בתמיסת ניתוק ללא טריפסין במקום טריפסין מכיוון שטריפסין יכול לשבש את סמן היצמדות פני השטח של התא CD-31. הוסף 8 מ”ל של תווך בסיסי כדי לנטרל את תמיסת ניתוק התא ולהעביר את התוכן לצינור חרוטי 15 מ”ל. יש לסחוט כלפי מטה במהירות של 400 x גרם במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר. מוציאים את הסופרנאטנט בעזרת פיפט פסטר זכוכית ומרחפים תאים ב-2 מ”ל של מדיום בזאלי. העבר את תרחיף התא 2 מ”ל לצינור פוליסטירן תחתון עגול של 5 מ”ל (ראה טבלת חומרים). מערבולת חרוזים מצופים נגד CD-31 למשך מספר שניות כדי להשעות מחדש את החרוזים ולהוסיף 30 מיקרוליטר של חרוזים לכל 2 מ”ל של תרחיף תאים. הדקו את המכסה. יש לדגור על הצינור למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על מסובב מקצה לקצה. לאחר מכן מניחים את הצינורות על מפריד מגנטי ומשאירים למשך 2 דקות. בעדינות באמצעות זכוכית פסטר, לשאוף את supernatant. הסר את הצינור מהמגנט, השהה מחדש את גלולת תא החרוז על ידי הוספת 3 מ”ל של מדיום בסיסי לצינור, ופיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים. החליפו את הצינור על המפריד המגנטי למשך 2 דקות, ולאחר מכן שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפט פסטר זכוכית. יש לחזור על השטיפות (שלב 4.6-4.7) לפחות 4 פעמים עד שהסופרנאטנט נראה צלול. לאחר השטיפה הסופית, להשעות מחדש את גלולת תא החרוז ב 3 מ”ל מדיום צמיחה להשלים ולהעביר אותו צלוחיות T-75. הוסף 7 מ”ל של מדיום הגידול השלם, ודגר ב 37 ° C באינקובטור לח 5% CO2 . למחרת לשטוף תאים עם HBSS/CMF, ולאחר מכן להוסיף 10 מ”ל של מדיום שלם טרי. יש להחליף את המדיה ב-10 מ”ל של מדיום שלם טרי כל 2-3 ימים עד למפגש של 90-95%.הערה: ברגע שהתאים נפגשים ~90-95%, מה שלוקח ~3-4 ימים, התרבית מוכנה לבידוד חיסוני משני. 5. בידוד חיסוני משני ותרבית תאי אנדותל יש לשטוף תאי אנדותל דבקים פעמיים עם 10 מ”ל HBSS/CMF. הוסף 2 מ”ל של תמיסת ניתוק תאים ללא טריפסין ודגור ב 37 ° C במשך ~ 5 דקות. ודא שכל התאים הורמו מהצלוחית. הוסף 8 מ”ל של תווך בסיסי כדי לנטרל תמיסת ניתוק תאים ולהעביר לצינור חרוטי 15 מ”ל. יש לסחוט כלפי מטה במהירות של 400 x גרם במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר. מוציאים את הסופרנאטנט בעזרת צינור פסטר זכוכית ומרחפים מחדש את התאים ב -2 מ”ל של מדיום בסיסי. מעבירים את מתלה התאים 2 מ”ל לצינור פוליסטירן תחתון עגול 5 מ”ל. מערבולת נגד CD-102 חרוזים מצופים במשך כמה שניות כדי להשעות מחדש את החרוזים ולהוסיף 30 μL של חרוזים עבור כל 2 מ”ל של תרחיף התא. הדקו את המכסה. דוגרים על הצינור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על מסובב מקצה לקצה. מניחים את הצינורות על מפריד מגנטי ומשאירים למשך 2 דקות. לאחר מכן שאפו בעדינות את הסופרנאטנט באמצעות פיפט פסטר זכוכית. הסר את הצינור מהמגנט, השהה מחדש את גלולת תא החרוז על ידי הוספת 3 מ”ל של מדיום בסיסי לצינור, ופיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים. החליפו את הצינור על המפריד המגנטי למשך 2 דקות לפני שתשאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפט פסטר זכוכית. יש לחזור על השטיפות (שלב 5.6-5.7) 4 פעמים או יותר עד שהסופרנאטנט נראה צלול. לאחר השטיפה הסופית, להשעות מחדש את גלולת תא החרוז ב 3 מ”ל מדיום צמיחה להשלים ולהעביר אותו צלוחיות T-75. הוסף 7 מ”ל מדיום גידול מלא, ודגור ב 37 ° C באינקובטור לח 5% CO2 . למחרת לשטוף תאים עם HBSS/CMF, ולאחר מכן להוסיף 10 מ”ל של מדיום שלם טרי. יש להחליף את המדיה ב-10 מ”ל של מדיום שלם טרי כל 2-3 ימים עד למפגש של 90-95%. ברגע שתאי האנדותל נפגשים במלואם, הם מוכנים לניסויים. אין להשתמש בתאים מעבר למעבר השישי מכיוון שהזדקנות עלולה להתרחש, וסוגי תאים אחרים עשויים להשתלט. 6. אישור סמני פני השטח של תאי האנדותל על ידי ציטומטריית זרימה לאחר שימוש בתמיסת ניתוק תאים נטולת טריפסין כדי לנתק את התאים, יש להשהות מחדש את גלולת התא ל-1 x 105 תאים/מ”ל ו-aliquot 100 μL של תרחיף התא לשלושה צינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ”ל, המסומנים 1, 2 ו-3. לשטוף תאים עם 1 מ”ל של 1x PBS. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C. הסירו את מאגר הכביסה וחזרו על הפעולה פעמיים. להשעות מחדש את גלולת התא ב 100 μL של 1x PBS. לצינור 1, הוסף 1 μL של נוגדן CD-31 מצומד נגד עכבר (PECAM-1) (לדוגמה: נוגדן CD-31 נגד עכבר phycoerythrin (PE) ו- 1 μL של נוגדן CD-102 מצומד נגד עכבר (ICAM-2) (לדוגמה: נוגדן CD102 נגד עכבר פלואורסצאין (FITC) (ראה טבלת חומרים). לצינור 2, הוסף את פקדי האיזוטיפ המתאימים. צינור מס’ 3 יישאר ללא כתמים. דוגרים על הצינורות על קרח ובחושך למשך 30-45 דקות. הוסף 1 מ”ל PBS לכל צינור, מערבול בעדינות, וצנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C. הסירו את הכביסה וחזרו על הפעולה שלוש פעמים. השהה מחדש את הגלולה הסופית ב 500 μL של PBS. שמור את הצינורות מכוסים ברדיד אלומיניום ב 4 ° C עד לניתוח. הניתוח צריך להסתיים תוך 3-4 שעות. קבל נתוני זרימה באמצעות ציטומטר. השתמש בדגימה לא מוכתמת כבקרה שלילית כדי להגדיר כראוי מתח לייזר בהתאם לאוטופלואורסצנטיות של התא. שער אוכלוסיית תאים כוללת עם חלקה מפוזרת קדימה וחלקת פיזור צדדית.הערה: לאחר אי הכללת תאים כפולים, תאים חיוביים כפולים CD31+ CD102+ מוגדרים כתאי אנדותל.