Uso de tinción de rojo de alizarina para detectar la pérdida ósea inducida químicamente en larvas de pez cebra
Summary
Aquí, hemos utilizado la tinción de rojo alizarina para mostrar que la exposición al acetato de plomo causa un cambio de masa ósea en las larvas de pez cebra. Este método de tinción se puede adaptar a la investigación de la pérdida ósea en larvas de pez cebra inducida por otros tóxicos peligrosos.
Abstract
La pérdida ósea inducida químicamente debido a la exposición al plomo (Pb) podría desencadenar una serie de impactos adversos en los sistemas esqueléticos humanos y animales. Sin embargo, los efectos y mecanismos específicos en el pez cebra siguen sin estar claros. El rojo de alizarina tiene una alta afinidad por los iones de calcio y puede ayudar a visualizar el hueso e ilustrar la masa mineral esquelética. En este estudio, nuestro objetivo fue detectar la pérdida ósea inducida por acetato de plomo (PbAc) en larvas de pez cebra mediante el uso de tinción de rojo de alizarina. Los embriones de pez cebra fueron tratados con una serie de concentraciones de PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) entre 2 y 120 h después de la fecundación. La tinción esquelética de montaje completo se realizó en larvas a los 9 días posteriores a la fertilización, y el área total teñida se cuantificó utilizando el software ImageJ. Los resultados indicaron que los tejidos mineralizados se tiñeron de rojo, y el área teñida disminuyó significativamente en el grupo de exposición a PbAc, con un cambio dependiente de la dosis en la mineralización ósea. Este artículo presenta un protocolo de tinción para investigar los cambios esqueléticos en los defectos óseos inducidos por PbAc. El método también se puede utilizar en larvas de pez cebra para la detección de la pérdida ósea inducida por otros productos químicos.
Introduction
Estudios recientes han confirmado que la osteoporosis debida a glucocorticoides, inhibidores de la aromatasa y consumo excesivo de alcohol es común 1,2. El plomo (Pb) es un metal tóxico que se encuentra en las plantas, el suelo y los ambientes acuáticos3. Aunque los efectos adversos de Pb en el cuerpo humano han atraído mucha atención, su impacto irreversible en el hueso necesita ser investigado más a fondo. La intoxicación por plomo causa una amplia gama de cambios patológicos tanto en el esqueleto en desarrollo como en el adulto, que afectan las actividades normales de la vida. Los estudios han encontrado una asociación entre la exposición crónica a Pb y el daño óseo4, incluyendo estructuras óseas deterioradas5,6, densidad mineral ósea reducida e incluso mayor riesgo de osteoporosis7.
El tejido mineralizado es de gran importancia para la resistencia ósea8, y la deposición de la matriz de mineralización ósea es un índice crítico de la formación ósea9. El rojo de alizarina tiene una alta afinidad por los iones de calcio, y la tinción con rojo de alizarina es un procedimiento estándar para evaluar la formación ósea10. De acuerdo con este método, el tejido mineralizado se tiñe de rojo, mientras que todo el resto del tejido permanece transparente. El área teñida se cuantifica mediante análisis de imagen digital11.
El pez cebra es un organismo modelo importante ampliamente utilizado en el descubrimiento de fármacos y modelos de enfermedades. Estudios genéticos en peces cebra y humanos han demostrado similitudes en los mecanismos subyacentes de la morfogénesis esquelética a nivel molecular12. Además, el cribado de fármacos o biomoléculas de alto rendimiento es más factible en grandes nidadas de pez cebra que en modelos murinos, facilitando el estudio mecanicista de moléculas proosteogénicas u osteotóxicas13. La tinción diferencial del esqueleto in toto10 se utiliza con frecuencia en el estudio de la displasia esquelética en pequeños vertebrados y fetos de mamíferos. La tinción de rojo de alizarina se realizó para investigar la toxicidad del desarrollo óseo de los productos químicos en larvas de pez cebra. Aquí, utilizamos el plomo como ejemplo para describir un protocolo para detectar defectos óseos inducidos por acetato de plomo en larvas de pez cebra.
Protocol
Representative Results
Discussion
El pez cebra es un modelo adecuado para estudiar la enfermedad metabólica ósea. En comparación con los modelos de roedores, los modelos de pez cebra son relativamente rápidos de establecer, y la medición de la gravedad de la enfermedad es más fácil. En larvas de pez cebra de tipo salvaje, la mineralización del esqueleto de la cabeza ocurre a 5 dpf y el esqueleto axial a 7 dpf15. Por lo tanto, los huesos craneales como PS, OP, CB y NC están bien desarrollados a 9 dpf. Después de que las l…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81872646; 81811540034; 81573173) y el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (PAPD).
Materials
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
Referenzen
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