종이 기반 토홀드 스위치 진단의 개발 및 환자 검증을 위한 설계-구현 연구

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 세계 의학 협회 헬싱키 선언에 의해 수립 된 인간 피험자와 관련된 의학 연구의 윤리 원칙을 포함하여 윤리적 기준 및 관련 지침에 따라 수행되어야합니다. 이 연구는 라이센스 프로토콜 번호 CAAE : 80247417.4.0000.5190에 따라 인간 연구 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구에 포함 된 모든 환자의 정보에 입각 한 동의는 진단 샘플에 대한 Fiocruz-PE 기관 검토위원회 (IRB)에 의해 포기되었습니다. 알림: PLUM 장치는 이후 ‘휴대용 플레이트 리더’라고 합니다. 1. 핵산서열 기반 증폭 프라이머의 전산 설계 Zika 게놈을 스캔하여 게놈 서열을 NCBI/뉴클레오티드 BLAST 25,26에 넣어 길이가 약200뉴클레오티드(nt)에서 300nt인 증폭 후보 영역 세트를 식별합니다. 게놈을 참조 RNA 서열(refseq_rna)과 비교하고 고도로 보존된 상태로 유지되고 인간 게놈과 상동성이 없는 부위를 검색합니다(다른 BLAST 매개변수는 변경되지 않음). 합성 토홀드 스위치를 설계할 사이트를 두 개 이상 선택하십시오. Deiman et al.27 의 선택 기준을 사용하여 각 후보 증폭 영역에 대한 정방향 및 역방향 핵산 서열 기반 증폭 프라이머 쌍을 생성합니다. 간단히 말해서, 프라이머 설계를위한 다음 기준을 따르십시오 : (1) 40 % -60 % 사이의 GC 함량; (2) 41°C 이상의 DNA 용융 온도를 갖는 길이 20 내지 24 nt; (3) 4개 이상의 동일한 뉴클레오티드의 실행 없음; (4) 최종 3′ 뉴클레오티드는 A 염기이고; (5) 낮은 프라이머 2차 구조 및 이량체 형성 확률. 각 표적 영역에 대해 8-10개의 프라이머 쌍을 스크리닝합니다(권장). T7 RNA 중합효소 (RNAP)를 사용하여 앰플리콘의 전사를 허용하기 위해 정방향 프라이머의 5’ 말단에 T7 프로모터 서열AATTC TAATACGACTCACTATAGGG(밑줄이 그어진 T7 프로모터 서열)를 포함하는 접두사 서열을 추가합니다. 프라이머를 DNA 합성 회사의 DNA 올리고로 주문하십시오. 2. 토홀드 스위치의 전산 설계 웹 사이트28 의 지침에 따라 NUPACK 3.2 버전29(핵산 디자인 제품군)를 설치합니다. UNIX 운영 체제와 MATLAB(수치 컴퓨팅 플랫폼)을 프로그래밍 언어로 사용합니다(권장). 단계 1.1에서와 같이 토홀드 스위치 설계에 대한 관심 병원체에 특이적인 표적 서열(예: 바이러스 게놈)을 식별합니다. 단계 1.2에서 생성된 핵산 서열 기반 앰플리콘으로부터 Zika 표적 서열을 선택한다.참고: 실제로 핵산 서열 기반 증폭 프라이머 또는 합성 토홀드 스위치는 사용자의 요구에 따라 먼저 설계하고 테스트할 수 있습니다. 관심의 특정 표적 영역이 이미 확립된 경우(예를 들어, 기존의 간행물 또는 진단 프로토콜로부터), 발가락 스위치 설계 및 스크리닝이 먼저 발생하고, 이어서 핵산 서열-기반 증폭 프라이머에 대한 설계 및 스크리닝이 발생할 수 있다. 확립된 표적 영역이 없는 경우, 먼저 전체 게놈에 대해 핵산 서열 기반 증폭 프라이머를 스크리닝하여 프라이머 증폭 효율을 위해 선택하는 동안 선택한 표적을 좁힙니다. 병원체에 대한 여러 서열을 사용할 수 있는 경우 전체 게놈을 스크리닝하는 대신 고도로 보존된 영역에 초점을 맞춘 핵산 서열 기반 증폭 프라이머를 설계하는 것이 가장 좋습니다. 컴퓨터에 필요한 MATLAB 소프트웨어를 다운로드하여 설치합니다. 소프트웨어에서 핵산 설계 제품군 기능을 호출할 수 있도록 환경 변수를 설정합니다. 이렇게 하려면 소프트웨어를 연 다음 기본 작업 폴더에서 startup.m 파일을 열거나 만듭니다. 그런 다음 다음 코드 줄을 startup.m 파일에 복사하고 마지막으로 핵산 디자인 제품군 바이너리가 포함된 폴더를 PATH에 추가합니다.NUPACKINSTALL = ‘/Users/[user_name]/…/nupack3.2.2’;setenv(‘NUPACKINSTALL’,NUPACKINSTALL);setenv(‘PATH’,[getenv(‘PATH’),sprintf(‘:%s/build/bin’,NUPACKINSTALL)]); 수치 컴퓨팅 플랫폼 소프트웨어를 열고 설계 소프트웨어 폴더로 이동합니다. https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN 에서 액세스할 수 있는 설계 알고리즘을 실행합니다. 입력 하위 폴더에 있는 design_input_file.csv에 대상 시퀀스를 입력합니다. 입력에는 표 1에 정의된 이름, 외부 시퀀스, 내부 시퀀스, 온도, 출력 이름 및 출력 시퀀스가 포함됩니다. 대상에 대한 프라이밍 부위가 아직 결정되지 않은 경우 내부 및 외부 시퀀스를 동일하게 유지합니다. 설계 과정에서 보고자의 처음 29nt만 고려됩니다. 완료되면 업데이트된 스프레드시트를 저장하고 닫습니다.참고: 출력 서열은 분석에 사용하도록 계획된 리포터 단백질(예: lacZ)의 서열입니다. 내부 및 외부 시퀀스를 지정하면 알고리즘이 프라이머 중 하나와 겹치는 합성 토홀드 스위치를 생성하지 않습니다. 또한 분석이 Zika 게놈의 세 가지 고유 한 부위를 인식하여 특이성을 개선하도록합니다. 설계 기능에 사용할 모수를 선택합니다: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file, 옵션). 매개 변수 값을 다음과 같이 채웁니다.num_designs – 소프트웨어의 각 대상 출력에 대한 상위 설계 수입니다. 기본값은 6이며 필요에 따라 변경할 수 있습니다(각 대상에 대해 최소 6개의 디자인 권장). input_file – 이 매개 변수는 입력 시퀀스 정보를 제공하는 파일의 이름을 지정합니다. 기본값은 ‘design_input_file.csv’이며 필요에 따라 변경할 수 있습니다. 다음 옵션 중에서 선택하십시오 – (1) 시리즈 A 및 시리즈 B : 코드가 생성 할 toehold 스위치의 버전. 시리즈 B를 1로, 시리즈 A를 0으로 설정하여 Zika 바이러스 진단6에 사용되는 형식인 시리즈 B 토홀드 스위치를 생성합니다. (2) 병렬: 설계를 계산하기 위해 여러 코어를 활용하려면 1로 설정합니다. 그렇지 않으면 0으로 설정합니다. (3) 안티센스: 타겟 입력의 안티센스 시퀀스(즉, 역방향 보수)를 혼성화하는 토홀드 스위치를 생성하기 위해 1로 설정하고; 그렇지 않으면 0으로 설정합니다. 선택한 매개변수 toehold_switch_design_run(num_designs,input_file,options)를 사용하여 설계 기능을 실행합니다. 그런 다음 알고리즘은 관심 대상에 대한 토홀드 스위치 설계를 생성하기 시작합니다. 설계가 완료되면 final_designs 폴더에서 상단 토홀드 스위치 설계 시퀀스와 해당 대상 시퀀스를 .csv 형식 스프레드시트 형식으로 찾습니다. 상기 알고리즘에 의해 생성된 토홀드 스위치 DNA 서열은 5′ 말단에 T7 프로모터 서열 및 3’ 말단에 보존된 21 nt 링커 서열 AACCTGGCGGCAGCAAAAG를 포함할 것이다. 생성된 상단 발가락 스위치 설계 서열을 NCBI-BLAST에 놓고 서열 상동성을 확인하여 다른 일반적인 바이러스에 대해 스크리닝합니다. 40% 상동성 이하의 서열을 받아들입니다. 발가락 스위치 헤어핀 서열을 DNA 올리고로 주문하고 나중에 리포터 유전자와 함께 완전한 기능의 스위치로 조립합니다. 선택한 리포터 단백질에 따라 후속 센서 조립에 필요한 PCR 프라이머를 주문하십시오. 매개 변수 정의 이름 출력 토홀드 스위치 시퀀스의 원하는 이름입니다. 외부 시퀀스 증폭에서 생성 된 전체 NASBA 성적표. 내부 시퀀스 프라이머 결합 부위를 제외한 외부 서열. 외부 서열과 일치하지만 정방향 및 역방향 프라이머에 결합하는 전사체 부분은 제외합니다. 온도 알고리즘이 RNA 구조를 계산하는 데 사용하는 온도입니다. 출력 이름 출력 유전자의 이름(예: lacZ, gfp). 출력 순서 출력 유전자의 서열. 표 1: 토홀드 스위치 설계 소프트웨어에 사용되는 각 매개변수의 정의. 3. PCR에 의한 토홀드 스위치 구축 알림: 이 단계에서는 오버랩 확장 PCR에 의한 LacZ 토홀드 스위치의 구성을 설명합니다. 여기서, DNA 올리고는 순방향 프라이머로 사용되고 T7 터미네이터는 역방향 프라이머로 사용된다. 우리는 pCOLADuet-LacZ 플라스미드를 lacZ 유전자의 주형으로 사용합니다 (addgene : 75006). T7 터미네이터가 최종 구축물에 포함되는 경우 해당 서열을 포함하는 다른 DNA 주형을 주형으로 사용할 수 있습니다. 합성 DNA 올리고가 상업적 공급자로부터 수령되면, 합성 DNA의 용액을 준비하고 뉴클레아제가 없는 물에서 10μM의 농도로 역증폭 프라이머를 준비한다. 표 2에 따라 얼음 위의 PCR 튜브에서 반응을 조립합니다.참고: PCR 볼륨은 필요에 따라 확장할 수 있습니다. 최소량의 pCOLADuet-LacZ DNA 주형을 사용하여 추가적인 플라스미드 제거 단계 또는 배경 LacZ 신호가 필요하지 않도록 합니다. 더 많은 DNA 주형 양의 경우, DpnI 제한 효소 소화로 PCR을 따라 잔류 플라스미드 주형을 제거합니다. 표 3에 나열된 사이클링 조건에 따라 열 순환기에 반응을 넣습니다. 아가로스 겔 상에서 PCR 산물을 분석한다(도 2; 보충 프로토콜 및30 참조). 스핀 컬럼 기반 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 제품을 정제하고 제조업체의 지침에 따라 뉴클레아제가 없는 물 15-30μL에서 DNA를 용리합니다. 분광 광도계를 사용하여 DNA를 정량화합니다. 구성 요소 음량 농도 5X Q5 반응 버퍼 10 μL 1배 10 mM dNTP 1 μL 200 마이크로미터 10 mM 포워드 프라이머 (합성 스위치 DNA FW) 2.5 μL 0.5 마이크로미터 10mM 리버스 프라이머(T7 터미네이터 RV) 2.5 μL 0.5 마이크로미터 Template DNA (pCOLADuet-LacZ) 변수 <1 ng Q5 고충실도 DNA 중합효소 0.5 μL 0.02 U/μL 뉴클레아제가 없는 물 50 μL까지 – 표 2: 토홀드 스위치를 구성하는 데 사용되는 PCR 구성 요소. 걸음 온도 시간 초기 변성 98 °C 30초 35 사이클 변성 98 °C 10초 어 닐 링 60 °C 20초 확장 72 °C 1.45 분 최종 확장 72 °C 5 분 들다 4 °C – 표 3: PCR에 의한 토홀드 스위치 구성 중 사용된 사이클링 조건. 4. 합성 RNA 표적(트리거)의 제조 분자 생물학 설계 소프트웨어를 사용하여 업스트림 T7 프로모터 서열을 포함하도록 합성 트리거 RNA 주형(1.1단계에서 선택)을 수정하여 전체 주형이 짧게 유지되도록 합니다(<200bp). 트리거 서열 프라이머를 증폭하기 위해 정방향 및 역방향 프라이머를 설계합니다(올리고 서열에 대해서는 보충 프로토콜 참조). 서열을 DNA 올리고로 정렬합니다. 일단 수신되면, 합성 트리거 DNA 및 증폭 프라이머를 뉴클레아제가 없는 물에서 10 μM로 재구성한다. 표 2 에 따라 얼음 위의 얇은 벽 튜브에 해당 PCR을 조립하고 0.5μL의 트리거 DNA 울트라머(최종 농도 0.1μM)를 주형 DNA로 사용합니다. 반응을 열 순환기에 넣고 표 3에 나열된 사이클링 조건을 사용합니다. 15초의 연장 시간을 사용합니다. 품질을 평가하고 단계 3.3 및 보충 프로토콜에 설명된 대로 트리거 PCR 제품을 정제합니다.참고: 공정을 신속하게 처리하기 위해 컬럼 정제된 트리거 PCR 제품을 초기 토홀드 스위치 스크리닝에 직접 사용할 수도 있습니다. 5. 선택된 트리거 서열의 시험관 내 전사 표 4에 따라 얼음 위에 반응 성분을 조립하십시오. 37°C에서 4시간 동안 시험관내 전사(IVT) 반응을 인큐베이션하고, 이어서 DNase I 처리하여 주형 DNA를 제거하였다. DNase I 단계의 경우, 70μL의 뉴클레아제-없는 물, 10μL의 10x DNase I 완충액, 및 2μL의 DNase I (RNase-없음)을 첨가하고, 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다. 즉시 단계 5.4로 진행하지 않으면, 50 mM EDTA를 첨가하여 DNase I을 불활성화시키고 65°C에서 10분 동안 열 불활성화시킨다. 선택적 단계: IVT 제품에 대한 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(예: 요소-PAGE) 분석을 수행하여 보충 프로토콜에 설명된 대로 RNA 품질을 평가합니다. 제조업체의 지침에 따라 컬럼 기반 RNA 정화 키트를 사용하여 트리거 IVT 제품을 정제한 다음 분광 광도법을 사용하여 RNA 농도와 순도를 정량화합니다. RNA의 몰 농도 및 복제 수 / μL를 결정하는 방법에 대한 지침은 보충 프로토콜을 참조하십시오. 구성 요소 음량 농도 10X 반응 버퍼 1.5 μL 0.75배 25 mM NTP 믹스 6 μL 7.5 밀리미터 템플릿 트리거 DNA 엑스 μL 1 μg T7 RNA 중합효소 혼합물 1.5 μL – 뉴클레아제가 없는 물 엑스 μL 20 μL까지 표 4: 선택된 트리거 서열의 시험관내 전사(IVT). 6. 스위치의 초기 스크리닝 알림: 이 섹션에서는 셀이 없는 종이 기반 토홀드 스위치 반응 설정과 관련된 단계와 고성능 토홀드 스위치를 스크리닝하는 방법에 대해 설명합니다. 6.10단계에서 사용된 BSA 차단 여과지는 보충 프로토콜에 설명된 대로 미리 준비해야 합니다. 25mg의 분말을 1mL의 뉴클레아제가 없는 물에 용해시켜 CPRG 원액을 준비합니다. 용액을 항상 얼음 위에 보관하고 장기간 사용하려면 -20 ° C에서 보관하십시오. 설정할 반응 수를 결정합니다. 평가된 각 토홀드 스위치에 대해 마스터 믹스에서 발생할 수 있는 배경 신호를 설명하기 위해 주형 제어 없음(스위치 없음 및 표적 RNA 없음-세포 없는 단독 제어라고도 함)을 포함합니다. 표적 RNA가 없는 경우 백그라운드 스위치 누설 또는 OFF 속도를 평가하기 위한 스위치 전용 제어를 포함합니다. 용액 A, 용액 B, RNase 억제제 및 CPRG의 무세포 반응 마스터 혼합물을 표 5에 나열된 표준 프로토콜에 따라 얼음 위에 조립합니다.참고: 여기에 설명된 단계는 피펫팅 오류를 설명하기 위해 10% 부피가 추가된 1.8μL 삼중 반응에 충분한 마스터 믹스를 위한 것입니다. 마스터 믹스 볼륨은 선별된 토홀드 스위치의 수에 따라 필요에 따라 조정해야 합니다. 각 삼중 무세포 반응에 대해 마스터 믹스를 PCR 튜브에 분주하고 모든 튜브를 얼음 위에 유지합니다. 무세포 단독 대조군으로 따로 보관된 튜브의 경우, 뉴클레아제가 없는 물을 최종 부피 5.84μL에 첨가하고, 위아래로 피펫팅하여 혼합하고, 짧게 원심분리합니다. 튜브의 나머지 부분에 대해, PCR 정제된 토홀드 스위치 DNA를 최종 농도 33 nM로 첨가한다. 스위치 단독 대조군으로 따로 보관된 튜브의 경우 뉴클레아제가 없는 물을 최종 부피 5.84μL에 추가합니다. 토홀드 스위치와 표적 RNA 조합을 테스트하기 위해 따로 보관된 튜브의 경우 시험관 내 전사된 표적 RNA를 최종 농도 1μM로 추가합니다. 그런 다음 뉴클레아제가 없는 물을 최종 부피 5.84μL까지 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 모든 반응을 완전히 혼합하고 짧게 원심분리합니다. 384웰의 투명한 검은색 바닥 플레이트의 반응 웰을 둘러싼 웰에 뉴클레아제가 없는 물 30μL를 추가합니다. 이는 실험 과정에서 증발을 최소화하고 재현성을 향상시킵니다.알림: 휴대용 플레이트 리더 장치를 사용하는 경우 플레이트 위에 PCR 호일을 놓고 정밀 나이프를 사용하여 반응용 웰과 네 모서리 웰 각각을 잘라냅니다. PCR 호일은 휴대용 플레이트 리더 카메라가 빈 우물에서 과다 노출되는 것을 방지합니다. 2mm 생검 펀치와 핀셋을 사용하여 BSA 차단 여과지 디스크를 절단하고 펀치를 배출하거나 핀셋을 사용하여 반응 웰에 넣습니다(BSA 차단 여과지 준비를 위한 보충 프로토콜 참조). 각 반응 튜브에서 1.8 μL 부피의 384웰 플레이트의 여과지 디스크로 삼중 분주하여 모든 샘플과 384웰 플레이트를 항상 얼음 위에 유지합니다.알림: 휴대용 플레이트 리더 장치를 사용하는 경우 1.8웰 플레이트의 네 모서리 각각에 0.6μL의 CPRG(384mg/mL)를 추가합니다. CPRG의 노란색은 이미지 분석에서 디지털 멀티웰 플레이트 템플릿의 정렬을 위해 휴대용 플레이트 리더에 패턴 인식을 제공합니다. 증발을 방지하기 위해 플레이트의 웰을 PCR 필름으로 덮으십시오. 플레이트를 플레이트 리더에 놓고 37°C에서 130분 동안 분당 OD570 을 읽습니다. 구성 요소 음량 반응당 최종 농도 솔루션 A 2.38 μL 40% 솔루션 B 1.78 μL 30% RNase 억제제 0.03 μL 0.5% V/V 심폐 소생술 (25 밀리그램 / 밀리리터) 0.14 μL 0.6 밀리그램 / 밀리람베르트 토홀드 스위치 엑스 μL 33 nM 표적 RNA 엑스 μL 1 마이크로미터 뉴클레아제가 없는 물 5.94 μL까지 – 총 볼륨: 5.94 μL 표 5: PURExpress 무세포 전사-번역 반응 성분. 7. 고성능 토홀드 스위치 식별 참고: 이 섹션에서는 6단계의 데이터를 분석하여 앞으로 진행할 최상의 토홀드 스위치를 선택하는 방법에 대해 설명합니다. 먼저 배경 OD570 흡광도로 정규화하여 데이터 분석을 시작합니다. 이렇게 하려면 다른 OD570 측정에서 스위치 또는 표적 RNA가 없는 반응(즉, 무세포 단독 웰)의OD570 측정값을 뺍니다. 3점 이동 평균을 사용하여 정규화된 데이터를 평활화하고 각 웰의 최소값을 0으로 조정합니다. 토홀드 스위치들(27B, 33B, 47B)에 대해 수집된 정규화된 시간-코스 데이터의 예는 도 3 을 참조한다. 이 처리된 데이터를 사용하여 토홀드 스위치와 타겟 및 스위치 단독 웰 사이의 색상 변화율(즉, 시간 경과에 따른 OD570 의 변화)의 차이를 결정하여 폴드 변화(또는 ON/OFF 비율)를 계산합니다(비율 계산을 위한 보충 프로토콜 참조; 그림 4). 추가 특성화를 위해 ON/OFF 폴드 변화가 가장 높은 스위치를 선택하십시오. 가장 낮은 접힘 변화를 표시하는 성능이 좋지 않은 토홀드 스위치는 생략합니다. 8. 핵산서열 기반 증폭 프라이머 스크리닝 및 민감도 참고: 다음 단계에서는 먼저 기능적 등온 증폭 프라이머에 대한 스크리닝을 수행한 다음 등온 증폭과 결합될 때 주어진 발판 스위치가 안정적으로 감지할 수 있는 합성 RNA의 μL당 표적 RNA 사본 수를 결정하여 민감도를 평가합니다. 등온 증폭 후 무세포 반응을 수행하여 성공적인 핵산 서열 기반 증폭 프라이머 세트를 식별합니다. 그러나, 먼저 후보 프라이머 세트의 풀을 좁히기 위해 핵산 서열 기반 증폭 반응에서 폴리아크릴아미드 또는 아가로스 겔을 실행하는 것이 더 비용 효율적일 수 있다. 그 경우, 적절한 앰플리콘 크기로 겔 상에 밴드를 생성하는 핵산 서열 기반 증폭 프라이머 세트는 후속 무세포 스크리닝을 위해 후보로 선정될 수 있다. 뉴클레아제가 없는 물에서 모든 정방향 및 역방향 프라이머 세트의 25μM 스톡 용액을 만듭니다( 보충 프로토콜 참조). 설정해야 하는 핵산 서열 기반 증폭 반응과 후속 무세포 반응의 수를 결정합니다. 이것은 토홀드 스위치의 수와 각각의 프라이머 세트에 따라 다릅니다.참고: 프라이머를 스크리닝할 때, 프라이머 관련 비특이적 증폭으로 인해 발생할 수 있는 배경 아티팩트를 설명하기 위해 각 프라이머 세트에 대해 항상 주형 없음 대조군을 포함하는 것이 중요합니다. 다음과 같이 하나의 5μL 반응을 설정합니다(필요에 따라 확장). 얼음에서 모든 시약을 해동하십시오. 반응 완충액, 뉴클레오티드 믹스, 및 RNase 억제제의 반응 마스터 믹스를 표 6에 따라 조립한다. 흰색 침전물이 가용화될 때까지 위아래로 피펫팅하여 완전히 혼합한 다음 분취량을 PCR 튜브에 분주합니다.마스터 믹스가 핵산 서열 기반 증폭 프라이머를 스크리닝하기 위한 것이라면 먼저 마스터 믹스에서 프라이머를 제외합니다(마스터 믹스 2.55μL 분주). 그렇지 않으면, 프라이머 민감도 분석을 수행하는 경우, 프라이머가 마스터 믹스에 포함될 수 있다(이 경우 2.75 μL 분취량 분주). 변성 및 평형 단계 후에 효소 혼합물을 추가하십시오. 핵산 서열 기반 증폭 프라이머를 스크리닝하는 경우, 정방향 및 역방향 프라이머를 적절한 튜브에 첨가한다. 열 순환기에서 표 7에 설명된 대로 배양 프로토콜을 설정합니다. 2pM 또는 약 106 copyies /μL에서 1 μL의 뉴클레아제 없는 물 또는 1 μL의 표적 트리거 RNA를 추가하고 그에 따라 튜브에 라벨을 붙입니다. 부드러운 피펫팅으로 혼합하고 튜브를 짧게 회전시킵니다.참고: 프라이머 세트 스크리닝의 경우 등온 증폭 방법의 검출 하한에 충돌하지 않을 만큼 충분히 높지만 증폭이 발생하지 않을 경우 발가락 스위치를 활성화할 만큼 충분히 높지 않은 표적 트리거 RNA의 농도를 사용하십시오. 튜브를 열 순환기로 옮기고 배양을 시작하십시오. 12분 후 튜브를 제거하고 각 튜브에 효소 혼합물 1.25μL를 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 혼합하고 튜브를 간단히 원심분리합니다.알림: 이 시점에서 튜브는 실온에서 보관할 수 있습니다. 그러나 효소 혼합물은 튜브에 추가 될 때까지 얼음 위에 보관해야합니다. 튜브를 열 순환기로 되돌리고 41°C 유지 단계를 건너뛰고 1시간 반응 배양을 시작합니다.참고: 배양 후 반응물을 당일 처리를 위해 얼음에 두거나 나중에 처리하기 위해 -20°C에서 냉동할 수 있습니다. 6.2-6.7단계 및 표 8 단계에 따라 종이 기반 무세포 토홀드 스위치 반응을 조립하여 프라이머 성능을 평가합니다. 7.1-7.2단계 및 그림 3에 설명된 대로 데이터를 분석합니다.참고: 앞서 언급한 컨트롤 외에도 반응에서 발생할 수 있는 배경 신호를 설명하기 위해 음성 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다. 또한, NO-NASBA 증폭 대조군으로서 표적 RNA의 스위치 및 2 pM (최종 농도)을 갖는 대조군을 포함하는 것도 중요하다. 민감도 분석을 진행할 후보 프라이머 쌍을 식별합니다. 프라이머 쌍은 인큐베이션된 반응의 첨가 후에 발가락 스위치 활성화가 발생하는지 여부에 기초하여 선택된다. 필요한 경우 더 많은 프라이머 조합으로 프라이머 스크린을 반복합니다. RNA 샘플을 항상 얼음 위에 보관하고 뉴클레아제가 없는 물에서 표적 RNA의 연속 희석 세트를 만드십시오: 104, 103, 10 2, 101 및 100 RNA 사본/μL. 선택된 프라이머 세트(단계 8.2-8.7)로 핵산 서열 기반 증폭 및 무세포 반응을 반복하고, 최상의 감도를 제공하는 프라이머 세트를 식별하기 위해 연속 희석 시리즈를 테스트합니다. 프라이머 세트 감도를 결정하기 위한 결과의 예는 도 5를 참조한다.참고: 이상적으로, 선택된 토홀드 스위치와 프라이머 쌍은 RNA의 μL당 1-100개의 표적 RNA 사본을 검출해야 합니다(스톡 용액 농도). 핵산서열 기반 증폭 민감도 실험을 생물학적 삼중으로 반복한다. 이 단계는 환자 샘플을 사용한 실험으로 이동하기 전에 결과의 재현성을 확인하는 역할을 합니다. 선택적: 장기간 사용 및 수송을 위한 스위치 DNA의 신뢰할 수 있는 공급원을 갖기 위해, 임의의 통상적인 클로닝 방법을 사용하여 선택된 스위치 서열(들)을 플라스미드로 클로닝한다. 유사하게, 표적 트리거 RNA 서열은 또한 저장을 위해 선택된 플라스미드 내로 클로닝될 수 있다. 구성 요소 반응당 부피 최종 농도 나스바 반응 버퍼 1.67 μL 1배 나스바 뉴클레오티드 믹스 0.833 μL 1배 25μM 순방향 프라이머 0.1 μL 0.5 마이크로미터 25μM 리버스 프라이머 0.1 μL 0.5 마이크로미터 RNase 억제제 (40 U / μL) 0.05 μL 0.4 U/μL 표적 RNA 1 μL 나스바 효소 믹스 1.25 μL 1배 총 볼륨 5 μL 표 6: NASBA 반응 성분. 걸음 온도 시간 변성 65 °C 2 분 평형 41 °C 10 분 들다 41 °C ∞ 잠복 41 °C 1시간 들다 4 °C – 표 7 : NASBA의 반응 조건. 구성 요소 음량 반응당 최종 농도 솔루션 A 2.38 μL 40% 솔루션 B 1.78 μL 30% RNase 억제제 0.03 μL 0.5% V/V 심폐 소생술 (25 밀리그램 / 밀리리터) 0.14 μL 0.6 밀리그램 / 밀리람베르트 토홀드 스위치 엑스 μL 33 nM 표적 RNA (해당되는 경우) 엑스 μL 1 마이크로미터 나스바 (해당되는 경우) 0.85 μL 1:7 뉴클레아제가 없는 물 5.94 μL까지 – 총 볼륨: 5.94 μL 표 8: 종이 기반 무세포 반응 성분. 9. 환자 샘플 수집 및 바이러스 RNA 추출 알림: 이 섹션에서는 RNA 정제 키트를 사용하여 환자 샘플을 수집하고 RNA를 추출하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 아래 프로토콜은 말초 혈액에서 혈청을 얻는 데 사용됩니다. 이 연구에 사용 된 샘플은 브라질 Pernambuco 주에서 발열, 발진, 관절통 또는 기타 관련 아르보 바이러스 감염 증상을 나타내는 환자로부터 수집되었습니다. 아르보 바이러스에 감염된 것으로 의심되는 환자로부터 말초 혈액 샘플을 수집합니다. 표준 무균 기술을 사용하여 정맥 천자 (전혈관)를 수행하십시오. 샘플 튜브에 익명의 코드와 샘플 수집 날짜를 표시하십시오. 혈액을 원심분리하여 혈청을 2,300 x g 에서 10분 동안 분리합니다. 피펫을 사용하여 1.5mL 튜브에서 RNA 추출에 사용할 혈청 분취량(200μL)을 준비합니다.참고: 샘플 수집 직후 RNA 추출을 수행할 수 없는 경우 혈청 샘플은 다운스트림 적용 전에 -80°C에서 보관해야 합니다. 캐리어 RNA가 포함된 준비된 완충액 AVL(바이러스 용해 완충액) 560 μL를 1.5 mL 튜브에 피펫팅한다. 140 μL의 혈청을 튜브의 완충액 AVL/캐리어 RNA 혼합물에 추가합니다. 펄스 볼텍싱으로 15초 동안 혼합합니다. 실온에서 10분 동안 배양한 다음 샘플을 잠시 원심분리하여 튜브 바닥에 내용물을 수집합니다. 560 μL의 에탄올 (96 % -100 %)을 샘플에 첨가하고 15 초 동안 펄스 볼텍싱으로 혼합합니다. 혼합 후 샘플을 원심 분리하여 튜브 바닥에 내용물을 수집합니다. 림을 적시지 않고 9.4단계의 용액 630μL를 스핀 컬럼에 조심스럽게 추가합니다. 이 단계에 따라 캡을 닫고 6,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 스핀 컬럼을 깨끗한 2mL 수집 튜브에 넣고 여액이 들어 있는 사용한 수집 튜브를 버립니다. 스핀 컬럼을 조심스럽게 열고 9.5 단계를 반복하십시오. 스핀 컬럼을 조심스럽게 열고 500μL의 버퍼 AW1(세척 버퍼 1)을 추가합니다. 캡을 닫고 6,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 스핀 컬럼을 깨끗한 2mL 수집 튜브에 넣고 여액이 들어 있는 사용한 수집 튜브를 버립니다. 스핀 컬럼을 조심스럽게 열고 500μL의 버퍼 AW2(세척 버퍼 2)를 추가합니다. 캡과 원심분리기를 20,000 x g 에서 3분 동안 닫습니다. 스핀 컬럼을 깨끗한 2mL 수집 튜브에 넣고 여액이 들어 있는 사용한 수집 튜브를 버립니다. 다운스트림 효소 반응에 문제를 일으킬 수 있는 잔류 완충액 AW2에 의한 오염을 방지하려면 스핀 컬럼을 깨끗한 2mL 수집 튜브에 넣고 사용한 수집 튜브를 여액과 함께 폐기하십시오. 20,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 스핀 컬럼을 깨끗한 1.5mL 튜브에 넣고 사용한 수집 튜브를 여액과 함께 버립니다. 스핀 컬럼을 조심스럽게 열고 실온과 평형화된 60μL의 버퍼 AVE(용리 버퍼)를 추가합니다. 이 단계에 따라 캡을 닫고 실온에서 1분 동안 배양합니다. 6,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 용출된 RNA를 NASBA 및 RT-qPCR의 입력으로 병렬로 사용할 수 있습니다. 8.3 – 8.11단계에 따라 추출된 환자 RNA 1μL를 사용하여 핵산 서열 기반 증폭 및 종이 기반 무세포 반응을 수행하여 음성 및 양성 대조군 반응이 포함되도록 합니다. 반응 후, 384-웰 반응 플레이트를 제조하고 37°C의 휴대용 플레이트 판독기 장치에서 분석을 실행합니다( 보충 프로토콜의 세부 정보 참조).참고: 배양된 지카 바이러스에서 추출한 104 및 102 PFU/mL의 두 RNA 농도는 임상 검증 중 모든 실험에서 양성 대조군으로 사용됩니다. 앞서 언급한 대조군 외에도 트리거(10ng/μL)를 양성 대조군으로 포함하는 것도 중요합니다. 모든 실험이 끝나면 사용 가능한 플레이트 리더의 원시 데이터(.csv 파일)를 온라인 보안 데이터베이스에 업로드할 수 있습니다. 또한 휴대용 플레이트 리더는 샘플이 Zika 바이러스에 대해 양성인지 음성인지 여부를 나타내는 보고서를 생성합니다(그림 6). 배양 중에 얻은 모든 그래프의 예는 대표 결과 섹션을 참조하십시오(그림 7).참고: 사용자는 USB를 통해 휴대용 플레이트 리더에서 자신의 컴퓨터로 파일을 전송할 수도 있습니다. 10. 휴대용 플레이트 리더 장치 휴대용 플레이트 리더 장치(도 8)는 종래의 플레이트 리더(24)에 대한 대안으로서 사용될 수 있다. 프로토콜 및 대표 결과는 보충 프로토콜을 참조하십시오. 11. 지카 바이러스 검출을 위한 RT-qPCR 참고: 이 섹션에서는 환자 샘플에서 Zika 바이러스 검출을 위한 RT-qPCR을 수행하는 단계를 간략하게 설명합니다( 보충 프로토콜 참조). 오염을 방지하려면 RT-qPCR 구성 요소를 증폭 과정에서 격리된 영역(예: 클린 후드)에 조립합니다. RT-qPCR 버퍼, 효소 및 프라이머/프로브를 얼음이나 콜드 블록에 놓습니다. 그런 다음 표 9에 따라 얼음 위의 384웰 플레이트에 반응을 추가합니다.참고: 모든 실험에는 음성(추출 대조군 및 비주형 대조군[NTC]) 및 양성 대조군(104 PFU/mL)이 권장됩니다. 시약을 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 추가한 후 위아래로 피펫팅하여(와동하지 않음) 반응물을 혼합하고 각 웰에 6.5μL를 분주합니다. 각 RNA 주형 3.5μL를 3배로 추가합니다. 플레이트 위에 PCR 필름을 놓습니다. 384웰 플레이트를 600 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. 표 10에 설명된 다음 사이클링 조건을 사용하여 플레이트를 RT-qPCR 기계에 놓습니다. 결과를 분석하려면 RT-qPCR 기계 설계 및 분석 소프트웨어를 사용하고 자동 임계값 및 기준선을 고려하십시오(보충 프로토콜의 세부 정보 참조). 구성 요소 음량 농도 2X 콴티노바 프로브 RT-PCR 마스터 믹스 5 μL 1 엑스 100μM 순방향 프라이머 0.08 μL 0.8 마이크로미터 100μM 리버스 프라이머 0.08 μL 0.8 마이크로미터 25 μM 프로브 0.04 μL 0.1 마이크로미터 콴티노바 ROX 레퍼런스 염료 0.05 μL 1 엑스 콴티노바 프로브 RT 믹스 0.1 μL 1 엑스 템플릿 RNA 3.5 μL – 뉴클레아제가 없는 물 10 μL까지 – 표 9: 환자 샘플에서 지카 바이러스를 검출하기 위해 미국 질병통제예방센터-CDC USA 프로토콜을 기반으로 지카 바이러스 RNA를 증폭하기 위한 RT-qPCR 성분(31). 걸음 온도 시간 역전사 45 °C 15 분 PCR 초기 활성화 단계 95 °C 5 분 45 사이클 변성 95 °C 5초 어닐링/확장 결합 60 °C 45초 표 10: RT-qPCR에 대한 사이클링 조건.