İn Vitro Histon Chaperonlarının Analitik, Pull-Down ve Chaperoning Testleri Kullanılarak Karakterizasyonu
Summary
Bu protokol, histon şaperon oligomerizasyonu ve stabilitesini incelemek için analitik boyut dışlama kromatografisini, histon şaperon-histon etkileşimlerini çözmek için aşağı çekme testini, protein komplekslerinin stokiyometrisini analiz etmek için AUC’yi ve in vitro varsayılan bir histon şaperonu işlevsel olarak karakterize etmek için histon chaperoning testini içeren bir dizi yöntemi tanımlamaktadır.
Abstract
Histon proteinleri, ökaryotik kromatini oluşturmak için DNA ile birleşir. Kromatinin temel birimi, DNA tarafından sarılmış çekirdek histonları H2A, H2B, H3 ve H4’ün iki kopyasından oluşan bir histon oktamerden oluşan bir nükleozomdur. Oktamer, bir H2A / H2B dimerinin iki kopyasından ve bir H3 / H4 tetramerinin tek bir kopyasından oluşur. Yüksek yüklü çekirdek histonları, hücresel sitoplazma ve çekirdekteki çeşitli proteinlerle spesifik olmayan etkileşimlere eğilimlidir. Histon şaperonları, histonlardan çekirdeğe histonları taşıyan ve DNA üzerinde birikmelerine yardımcı olan, böylece nükleozom montaj sürecine yardımcı olan çeşitli bir protein sınıfı oluşturur. Bazı histon şaperonları H2A / H2B veya H3 / H4 için spesifiktir ve bazıları her ikisi için de şaperon olarak işlev görür. Bu protokol, pull-down testleri, analitik boyut dışlama kromatografisi, analitik ultra santrifüjleme ve histon chaperoning testi gibi in vitro laboratuvar tekniklerinin, belirli bir proteinin histon şaperonu olarak işlevsel olup olmadığını doğrulamak için birlikte nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır.
Introduction
DNA ve histon proteinlerinden oluşan nükleozomlar, kromatinin yapısal birimini oluşturur ve birkaç kritik hücresel olayı düzenler. Nükleozomlar, DNA’yı replikasyon, transkripsiyon ve çeviri 1,2 gibi çeşitli süreçlere erişilebilir kılmak için dinamik olarak yeniden konumlandırılır ve yeniden şekillendirilir. Son derece bazik olan histonlar ya hücresel ortamdaki asidik proteinlerle etkileşime girme eğilimindedir ya da kümelenmeye uğrar, böylece çeşitli hücresel kusurlara yol açar 3,4,5. Histon şaperonları adı verilen bir grup özel protein, histonların sitoplazmadan çekirdeğe taşınmasına yardımcı olur ve anormal histon-DNA agregasyon olaylarını önler 6,7. Temel olarak, çoğu histon şaperonu, histonları fizyolojik iyonik güçte DNA üzerine depolar ve aktarır, böylece nükleozomların oluşumuna yardımcı olur 8,9. Bazı histon şaperonların histon oligomerleri H2A/H2B veya H3/H410 için kesin bir tercihi vardır.
Histon şaperonları, DNA sentezine bağımlı veya bağımsız nükleozomları birleştirme yeteneklerine dayanarak karakterize edilir11. Örneğin, kromatin montaj faktörü-1 (CAF-1) bağımlıyken, histon regülatörü A (HIRA) DNA sentezi 12,13’ten bağımsızdır. Benzer şekilde, histon şaperonların nükleoplazman ailesi, sperm kromatin dekondensasyonu ve nükleozom montajı14’te rol oynar. Nükleozom montaj proteini (NAP) ailesi üyeleri, in vitro nükleozom benzeri yapıların oluşumunu kolaylaştırır ve sitoplazma ile çekirdek15 arasındaki histonların kesilmesinde rol oynar. Nükleoplazminler ve NAP ailesi proteinlerin her ikisi de fonksiyonel histon şaperonlarıdır, ancak herhangi bir yapısal özelliği paylaşmaz. Temel olarak, tek bir yapısal özellik, bir proteinin histon şaperon16 olarak sınıflandırılmasına izin vermez. Fonksiyonel ve biyofiziksel testlerin yapısal çalışmalarla birlikte kullanımı, histon şaperonları karakterize etmede en iyi sonucu verir.
Bu çalışma, bir proteini nükleozom montajına yardımcı olan bir histon şaperonu olarak karakterize etmek için biyokimyasal ve biyofiziksel yöntemleri açıklamaktadır. İlk olarak, histon şaperonların oligomerik durumunu ve stabilitesini analiz etmek için analitik boyut dışlama kromatografisi yapıldı. Daha sonra, histon şaperon-histon etkileşimlerinin itici güçlerini ve rekabetçi doğasını belirlemek için bir pull-down testi yapıldı. Bununla birlikte, bu etkileşimlerin hidrodinamik parametreleri, proteinin şekli ve kolon boyunca göçlerini etkileyen kompleksleri nedeniyle analitik boyut dışlama kromatografisi kullanılarak doğru bir şekilde hesaplanamamıştır. Bu nedenle, doğru moleküler ağırlık, etkileşimin stokiyometrisi ve biyolojik moleküllerin şeklini içeren çözelti içi makromoleküler özellikler sağlayan analitik ultrasantrifüjleme kullanılmıştır. Geçmiş çalışmalar, yScS11617, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120 gibi histon şaperonları fonksiyonel olarak karakterize etmek için in vitro histon chaperoning testini yaygın olarak kullanmıştır. Histon chaperoning testi, proteinleri histon şaperonlar olarak fonksiyonel olarak karakterize etmek için de kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, varsayılan bir histon şaperonun biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyonu için kapsamlı bir protokol setini göstermekte ve doğrulamaktadır. Burada, protokolleri göstermek için rekombinant olarak eksprese edilen ve saflaştırılan NAP ailesi proteinleri, AtNRP1 ve AtNRP2 ve AtFKBP53’ün N-terminal nükleoplazman alanı kullanılmıştır. Aynı deney seti, herhangi bir organizmadan daha önce karakterize edilmemiş histon şaperonların fonksiyonel özelliklerini tanımlamak için çok iyi kul…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu, Hindistan Hükümeti [CRG / 2018 / 000695 / PS] ve Biyoteknoloji Bölümü, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, Hindistan Hükümeti [BT / INF / 22 / SP33046 / 2019] ‘dan Dileep Vasudevan’a yapılan ekstramural hibelerin yanı sıra Yaşam Bilimleri Enstitüsü, Bhubaneswar’ın intramural desteği büyük ölçüde kabul edilmektedir. Bayan Sudeshna Sen ve Bayan Annapurna Sahoo’ya histon hazırlama konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Meslektaşlarımız Dr. Chinmayee Mohapatra, Bay Manas Kumar Jagdev ve Dr. Shaikh Nausad Hossain ile yapılan görüşmeler de kabul edilmektedir.
Materials
| Acetic acid (glacial) | Sigma | A6283 | |
| Acrylamide | MP Biomedicals | 814326 | |
| Agarose | MP Biomedicals | 193983 | |
| AKTA Pure 25M FPLC | Cytiva | 29018226 | Instrument for protein purification |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma | A3678 | |
| An-60Ti rotor | Beckman Coulter | 361964 | Rotor for analytical ultracentrifugation |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Coomassie brilliant blue R 250 | Sigma | 1.15444 | |
| Dialysis tubing (7 kDa cut-off) | Thermo Fisher | 68700 | For dialysing protein samples |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals | 100597 | |
| DNA Loading Dye | New England Biolabs | B7025S | |
| EDTA disodium salt | MP Biomedicals | 194822 | |
| Electronic balance | Shimadzu | ATX224R | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | |
| Ethidium bromide (EtBr) | Sigma | E8751 | |
| Gel Doc System | Bio-Rad | 12009077 | For imaging gels after staining |
| Horizontal gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 1704405 | Instrument for agarose gel electrophoresis |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | 320331 | |
| Imidazole | MP Biomedicals | 102033 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
| Micropipettes | Eppendorf | Z683779 | For pipetting of micro-volumes |
| Mini-PROTEAN electrophoresis system | Bio-Rad | 1658000 | Instrument for SDS-PAGE |
| N,N-methylene-bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800172 | |
| Nano drop | Thermo Fisher | ND-2000 | For measurement of protein and DNA concentrations |
| Ni-NTA agarose | Invitrogen | R901-15 | Resin beads for pull-down assay |
| Optima AUC analytical ultracentrifuge | Beckman Coulter | B86437 | Instrument for analytical ultracentrifugation |
| pH Meter | Mettler Toledo | MT30130863 | |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Plasmid isolation kit | Qiagen | 27104 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 1.07393 | |
| pUC19 | Thermo Fisher | SD0061 | Plasmid for supercoiling assay |
| Refrigerated high-speed centrifuge | Thermo Fisher | 75002402 | |
| SDS-PAGE protein marker | Bio-Rad | 1610317 | |
| SEDFIT | Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis | ||
| SEDNTERP | Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein | ||
| SigmaPrep Spin Columns | Sigma | SC1000 | For pull-down assay |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | S9888 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | MP Biomedicals | 102918 | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
| Superdex 75 Increase 10/300 GL | Cytiva | 29148721 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
| TEMED | Sigma | 1.10732 | |
| Topoisomerase I | Inspiralis | WGT102 | Enzyme used in plasmid supercoiling assay |
| Tris base | Merck | T1503 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Urea | MP Biomedicals | 191450 | |
| Water bath | Nüve | NB 5 | For heat treatment of protein samples |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma | M6250 |
Referenzen
- Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. Chromatin organization and transcriptional regulation. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).
- Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
- Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae. EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).
- Prado, F., Aguilera, A. Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability. Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).
- Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission. Cell. 44 (1), 43-52 (1986).
- Groth, A., et al. Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress. Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).
- Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).
- Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
- Akey, C. W., Luger, K. Histone chaperones and nucleosome assembly. Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).
- De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
- Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).
- Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development. EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).
- Ray-Gallet, D., et al. HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis. Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).
- Frehlick, L. J., Eirín-López, J. M., Ausió, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).
- Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).
- Elsässer, S. J., D’Arcy, S. Towards a mechanism for histone chaperones. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).
- Rodríguez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract. Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).
- Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones. Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).
- Huang, S., et al. Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).
- Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).
- Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).
- Scofield, B. T. K. H. . Protein Electrophoresis. , (2012).
- Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. Dialysis and concentration of protein solutions. Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).
- Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).
- Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation. Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).
- Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Current Protocols in Protein Science. , (2013).
- Schuck, P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).
- Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1. Molecules. 24 (12), 2258 (2019).
- Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA. Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).
- Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
- Newman, E. R., et al. Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).
- Edlich-Muth, C., et al. The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins. Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).
- Franco, A., et al. Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition. Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).
- Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone. FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).
- Graziano, G. Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3. Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).
- Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
- Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).
- Avvakumov, N., Nourani, A., Côté, J. Histone chaperones: Modulators of chromatin marks. Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).
- Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. Chaperoning histones during DNA replication and repair. Cell. 140 (2), 183-195 (2010).
- Chu, X., et al. Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B. PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).
- Heidarsson, P. O., et al. Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome. bioRxiv. , (2020).
