Este protocolo describe una batería de métodos que incluye cromatografía analítica de exclusión de tamaño para estudiar la oligomerización y estabilidad de la chaperona de histonas, ensayo de extracción hacia abajo para desentrañar las interacciones chaperona-histona de histonas, AUC para analizar la estequiometría de los complejos de proteínas y ensayo de acompañamiento de histonas para caracterizar funcionalmente una chaperona de histonas putativa in vitro.
Las proteínas histonas se asocian con el ADN para formar la cromatina eucariota. La unidad básica de la cromatina es un nucleosoma, formado por un octámero de histonas que consiste en dos copias de las histonas centrales H2A, H2B, H3 y H4, envueltas por el ADN. El octámero está compuesto por dos copias de un dímero H2A/H2B y una sola copia de un tetrámero H3/H4. Las histonas centrales altamente cargadas son propensas a interacciones no específicas con varias proteínas en el citoplasma celular y el núcleo. Las chaperonas de histonas forman una clase diversa de proteínas que transportan histonas desde el citoplasma al núcleo y ayudan a su deposición en el ADN, ayudando así al proceso de ensamblaje de nucleosomas. Algunas chaperonas de histonas son específicas para H2A/H2B o H3/H4, y algunas funcionan como chaperonas para ambas. Este protocolo describe cómo las técnicas de laboratorio in vitro , como los ensayos pull-down, la cromatografía analítica de exclusión de tamaño, la ultracentrifugación analítica y el ensayo de acompañamiento de histonas, podrían usarse en conjunto para confirmar si una proteína dada es funcional como una chaperona de histonas.
Los nucleosomas compuestos de ADN y proteínas histonas forman la unidad estructural de la cromatina y regulan varios eventos celulares críticos. Los nucleosomas se reposicionan y remodelan dinámicamente para hacer que el ADN sea accesible a diversos procesos como la replicación, la transcripción y la traducción 1,2. Las histonas que son altamente básicas tienden a interactuar con proteínas ácidas en el medio celular o sufren agregación, lo que lleva a varios defectos celulares 3,4,5. Un grupo de proteínas dedicadas llamadas chaperonas histonas ayudan al transporte de histonas desde el citoplasma hasta el núcleo y previenen eventos aberrantes de agregación histona-ADN 6,7. Fundamentalmente, la mayoría de las chaperonas de histonas almacenan y transfieren histonas al ADN con fuerza iónica fisiológica, ayudando así a la formación de nucleosomas 8,9. Algunas chaperonas de histonas tienen una preferencia definida por los oligómeros de histonas H2A/H2B o H3/H410.
Las chaperonas de histonas se caracterizan por su capacidad para ensamblar nucleosomas dependientes o independientes de la síntesis de ADN11. Por ejemplo, el factor de ensamblaje de la cromatina-1 (CAF-1) es dependiente, mientras que el regulador de histonas A (HIRA) es independiente de la síntesis de ADN12,13. Del mismo modo, la familia de nucleoplasminas de las chaperonas histonas está involucrada en la descondensación de la cromatina espermática y el ensamblaje de nucleosomas14. Los miembros de la familia de proteínas de ensamblaje de nucleosomas (NAP) facilitan la formación de estructuras similares a nucleosomas in vitro y están involucrados en el transporte de histonas entre el citoplasma y el núcleo15. Las nucleoplasminas y las proteínas de la familia NAP son chaperonas de histonas funcionales, pero no comparten ninguna característica estructural. Esencialmente, ninguna característica estructural única permite la clasificación de una proteína como una chaperona de histonas16. El uso de ensayos funcionales y biofísicos junto con estudios estructurales funcionan mejor para caracterizar las chaperonas de histonas.
Este trabajo describe métodos bioquímicos y biofísicos para caracterizar una proteína como una chaperona de histonas que ayuda al ensamblaje de nucleosomas. En primer lugar, se realizó cromatografía analítica de exclusión de tamaño para analizar el estado oligomérico y la estabilidad de las chaperonas de histonas. A continuación, se realizó un ensayo pull-down para determinar las fuerzas impulsoras y la naturaleza competitiva de las interacciones chaperona-histona de histonas. Sin embargo, los parámetros hidrodinámicos de estas interacciones no pudieron calcularse con precisión utilizando cromatografía analítica de exclusión de tamaño debido a la forma de la proteína y sus complejos que afectan su migración a través de la columna. Por lo tanto, se utilizó la ultracentrifugación analítica, que proporciona propiedades macromoleculares en solución que incluyen el peso molecular preciso, la estequiometría de interacción y la forma de las moléculas biológicas. Estudios anteriores han utilizado ampliamente el ensayo de acompañamiento de histonas in vitro para caracterizar funcionalmente las chaperonas de histonas como yScS116 17, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120. El ensayo de acompañamiento de histonas también se utilizó para caracterizar funcionalmente las proteínas como chaperonas de histonas.
Este trabajo demuestra y valida un conjunto completo de protocolos para la caracterización bioquímica y biofísica de una chaperona de histonas putativa. En esta invención, se utilizaron proteínas de la familia NAP expresadas y purificadas recombinantemente, AtNRP1 y AtNRP2, y el dominio de nucleoplasmina N-terminal de AtFKBP53 para demostrar los protocolos. El mismo conjunto de experimentos podría muy bien usarse para delinear los atributos funcionales de las chaperonas de histonas previamente no caracterizadas de …
The authors have nothing to disclose.
Las subvenciones extramuros a Dileep Vasudevan de la Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería del Gobierno de la India [CRG/2018/000695/PS] y el Departamento de Biotecnología, Ministerio de Ciencia y Tecnología del Gobierno de la India [BT/INF/22/SP33046/2019], así como el apoyo intramuros del Instituto de Ciencias de la Vida, Bhubaneswar, son muy reconocidos. Agradecemos a la Sra. Sudeshna Sen y a la Sra. Annapurna Sahoo por su ayuda con la preparación de histonas. También se reconocen las conversaciones con nuestros colegas el Dr. Chinmayee Mohapatra, el Sr. Manas Kumar Jagdev y el Dr. Shaikh Nausad Hossain.
Acetic acid (glacial) | Sigma | A6283 | |
Acrylamide | MP Biomedicals | 814326 | |
Agarose | MP Biomedicals | 193983 | |
AKTA Pure 25M FPLC | Cytiva | 29018226 | Instrument for protein purification |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma | A3678 | |
An-60Ti rotor | Beckman Coulter | 361964 | Rotor for analytical ultracentrifugation |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
Chloroform | Sigma | C2432 | |
Coomassie brilliant blue R 250 | Sigma | 1.15444 | |
Dialysis tubing (7 kDa cut-off) | Thermo Fisher | 68700 | For dialysing protein samples |
Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals | 100597 | |
DNA Loading Dye | New England Biolabs | B7025S | |
EDTA disodium salt | MP Biomedicals | 194822 | |
Electronic balance | Shimadzu | ATX224R | |
Ethanol | Sigma | E7023 | |
Ethidium bromide (EtBr) | Sigma | E8751 | |
Gel Doc System | Bio-Rad | 12009077 | For imaging gels after staining |
Horizontal gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 1704405 | Instrument for agarose gel electrophoresis |
Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | 320331 | |
Imidazole | MP Biomedicals | 102033 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
Micropipettes | Eppendorf | Z683779 | For pipetting of micro-volumes |
Mini-PROTEAN electrophoresis system | Bio-Rad | 1658000 | Instrument for SDS-PAGE |
N,N-methylene-bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800172 | |
Nano drop | Thermo Fisher | ND-2000 | For measurement of protein and DNA concentrations |
Ni-NTA agarose | Invitrogen | R901-15 | Resin beads for pull-down assay |
Optima AUC analytical ultracentrifuge | Beckman Coulter | B86437 | Instrument for analytical ultracentrifugation |
pH Meter | Mettler Toledo | MT30130863 | |
Phenol | Sigma | P4557 | |
Plasmid isolation kit | Qiagen | 27104 | |
Proteinase K | Sigma-Aldrich | 1.07393 | |
pUC19 | Thermo Fisher | SD0061 | Plasmid for supercoiling assay |
Refrigerated high-speed centrifuge | Thermo Fisher | 75002402 | |
SDS-PAGE protein marker | Bio-Rad | 1610317 | |
SEDFIT | Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis | ||
SEDNTERP | Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein | ||
SigmaPrep Spin Columns | Sigma | SC1000 | For pull-down assay |
Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
Sodium chloride (NaCl) | Merck | S9888 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | MP Biomedicals | 102918 | |
Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
Superdex 75 Increase 10/300 GL | Cytiva | 29148721 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
TEMED | Sigma | 1.10732 | |
Topoisomerase I | Inspiralis | WGT102 | Enzyme used in plasmid supercoiling assay |
Tris base | Merck | T1503 | |
Tween-20 | Sigma | P1379 | |
Urea | MP Biomedicals | 191450 | |
Water bath | Nüve | NB 5 | For heat treatment of protein samples |
β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma | M6250 |