In vitro Caratterizzazione degli Chaperoni degli istoni mediante saggi analitici, pull-down e chaperoning
Summary
Questo protocollo descrive una batteria di metodi che include la cromatografia analitica di esclusione dimensionale per studiare l’oligomerizzazione e la stabilità dell’istone chaperone, il saggio pull-down per svelare le interazioni chaperone-istone degli istoni, l’AUC per analizzare la stechiometria dei complessi proteici e il saggio di chaperoning degli istoni per caratterizzare funzionalmente un presunto chaperone istonico in vitro.
Abstract
Le proteine istoniche si associano al DNA per formare la cromatina eucariotica. L’unità di base della cromatina è un nucleosoma, costituito da un ottamero istonico costituito da due copie degli istoni H2A, H2B, H3 e H4, avvolti dal DNA. L’ottamero è composto da due copie di un dimero H2A/H2B e una singola copia di un tetramero H3/H4. Gli istoni del nucleo altamente carichi sono soggetti a interazioni non specifiche con diverse proteine nel citoplasma cellulare e nel nucleo. Gli chaperoni istonici formano una classe diversificata di proteine che trasportano gli istoni dal citoplasma al nucleo e aiutano la loro deposizione sul DNA, assistendo così il processo di assemblaggio del nucleosoma. Alcuni chaperoni istonici sono specifici per H2A / H2B o H3 / H4, e alcuni funzionano come chaperoni per entrambi. Questo protocollo descrive come le tecniche di laboratorio in vitro come i saggi pull-down, la cromatografia analitica ad esclusione dimensionale, l’ultra-centrifugazione analitica e il test di chaperoning degli istoni potrebbero essere utilizzate in tandem per confermare se una data proteina è funzionale come chaperone istonico.
Introduction
I nucleosomi composti da DNA e proteine istoniche formano l’unità strutturale della cromatina e regolano diversi eventi cellulari critici. I nucleosomi vengono riposizionati e rimodellati dinamicamente per rendere il DNA accessibile a vari processi come la replicazione, la trascrizione e la traduzione 1,2. Gli istoni altamente basici tendono ad interagire con le proteine acide nell’ambiente cellulare o subiscono aggregazione, portando così a vari difetti cellulari 3,4,5. Un gruppo di proteine dedicate chiamate chaperoni degli istoni aiuta il trasporto degli istoni dal citoplasma al nucleo e previene eventi aberranti di aggregazione istone-DNA 6,7. Fondamentalmente, la maggior parte degli chaperoni degli istoni immagazzinano e trasferiscono gli istoni sul DNA a forza ionica fisiologica, favorendo così la formazione dei nucleosomi 8,9. Alcuni chaperoni istonici hanno una netta preferenza per gli oligomeri istonici H2A/H2B o H3/H410.
Gli chaperoni istonici sono caratterizzati in base alla loro capacità di assemblare nucleosomi dipendenti o indipendenti dalla sintesi del DNA11. Ad esempio, il fattore di assemblaggio della cromatina-1 (CAF-1) è dipendente mentre il regolatore degli istoni A (HIRA) è indipendente dalla sintesi del DNA12,13. Allo stesso modo, la famiglia nucleoplasmina degli chaperoni istonici è coinvolta nella decondensazione della cromatina spermatica e nell’assemblaggio dei nucleosomi14. I membri della famiglia delle proteine di assemblaggio dei nucleosomi (NAP) facilitano la formazione di strutture simili ai nucleosomi in vitro e sono coinvolti nello spostamento degli istoni tra citoplasma e nucleo15. Le nucleoplasmine e le proteine della famiglia NAP sono entrambe chaperoni funzionali degli istoni ma non condividono alcuna caratteristica strutturale. Essenzialmente, nessuna singola caratteristica strutturale consente la classificazione di una proteina come chaperone istonico16. L’uso di saggi funzionali e biofisici insieme a studi strutturali funzionano meglio nella caratterizzazione degli accompagnatori degli istoni.
Questo lavoro descrive metodi biochimici e biofisici per caratterizzare una proteina come un chaperone istonico che aiuta l’assemblaggio del nucleosoma. In primo luogo, è stata effettuata una cromatografia analitica di esclusione dimensionale per analizzare lo stato oligomerico e la stabilità degli chaperoni istonici. Successivamente, è stato eseguito un test pull-down per determinare le forze motrici e la natura competitiva delle interazioni istone chaperone-istone. Tuttavia, i parametri idrodinamici di queste interazioni non hanno potuto essere calcolati con precisione utilizzando la cromatografia analitica di esclusione dimensionale a causa della forma della proteina e dei suoi complessi che influenzano la loro migrazione attraverso la colonna. Pertanto, è stata utilizzata l’ultracentrifugazione analitica, che fornisce proprietà macromolecolari in soluzione che includono il peso molecolare accurato, la stechiometria di interazione e la forma delle molecole biologiche. Studi precedenti hanno ampiamente utilizzato il test di chaperoning degli istoni in vitro per caratterizzare funzionalmente gli chaperoni istonici come yScS116 17, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120. Il saggio di chaperoning degli istoni è stato utilizzato anche per caratterizzare funzionalmente le proteine come chaperoni istoniche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo lavoro dimostra e convalida una serie completa di protocolli per la caratterizzazione biochimica e biofisica di un presunto chaperone istonico. Qui, le proteine della famiglia NAP espresse e purificate in modo ricombinante, AtNRP1 e AtNRP2, e il dominio nucleoplasmina N-terminale di AtFKBP53 sono stati utilizzati per dimostrare i protocolli. Lo stesso insieme di esperimenti potrebbe benissimo essere usato per delineare gli attributi funzionali di chaperoni istonici precedentemente non caratterizzati da qualsiasi o…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le sovvenzioni extramurali a Dileep Vasudevan dal Science and Engineering Research Board, Government of India [CRG/2018/000695/PS] e dal Department of Biotechnology, Ministry of Science and Technology, Government of India [BT/INF/22/SP33046/2019], nonché il supporto intramurale dell’Institute of Life Sciences, Bhubaneswar sono ampiamente riconosciuti. Ringraziamo la signora Sudeshna Sen e la signora Annapurna Sahoo per il loro aiuto nella preparazione degli istoni. Sono state riconosciute anche le discussioni con i nostri colleghi Dr. Chinmayee Mohapatra, Mr. Manas Kumar Jagdev e Dr. Shaikh Nausad Hossain.
Materials
| Acetic acid (glacial) | Sigma | A6283 | |
| Acrylamide | MP Biomedicals | 814326 | |
| Agarose | MP Biomedicals | 193983 | |
| AKTA Pure 25M FPLC | Cytiva | 29018226 | Instrument for protein purification |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma | A3678 | |
| An-60Ti rotor | Beckman Coulter | 361964 | Rotor for analytical ultracentrifugation |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Coomassie brilliant blue R 250 | Sigma | 1.15444 | |
| Dialysis tubing (7 kDa cut-off) | Thermo Fisher | 68700 | For dialysing protein samples |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals | 100597 | |
| DNA Loading Dye | New England Biolabs | B7025S | |
| EDTA disodium salt | MP Biomedicals | 194822 | |
| Electronic balance | Shimadzu | ATX224R | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | |
| Ethidium bromide (EtBr) | Sigma | E8751 | |
| Gel Doc System | Bio-Rad | 12009077 | For imaging gels after staining |
| Horizontal gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 1704405 | Instrument for agarose gel electrophoresis |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | 320331 | |
| Imidazole | MP Biomedicals | 102033 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
| Micropipettes | Eppendorf | Z683779 | For pipetting of micro-volumes |
| Mini-PROTEAN electrophoresis system | Bio-Rad | 1658000 | Instrument for SDS-PAGE |
| N,N-methylene-bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800172 | |
| Nano drop | Thermo Fisher | ND-2000 | For measurement of protein and DNA concentrations |
| Ni-NTA agarose | Invitrogen | R901-15 | Resin beads for pull-down assay |
| Optima AUC analytical ultracentrifuge | Beckman Coulter | B86437 | Instrument for analytical ultracentrifugation |
| pH Meter | Mettler Toledo | MT30130863 | |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Plasmid isolation kit | Qiagen | 27104 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 1.07393 | |
| pUC19 | Thermo Fisher | SD0061 | Plasmid for supercoiling assay |
| Refrigerated high-speed centrifuge | Thermo Fisher | 75002402 | |
| SDS-PAGE protein marker | Bio-Rad | 1610317 | |
| SEDFIT | Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis | ||
| SEDNTERP | Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein | ||
| SigmaPrep Spin Columns | Sigma | SC1000 | For pull-down assay |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | S9888 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | MP Biomedicals | 102918 | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
| Superdex 75 Increase 10/300 GL | Cytiva | 29148721 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
| TEMED | Sigma | 1.10732 | |
| Topoisomerase I | Inspiralis | WGT102 | Enzyme used in plasmid supercoiling assay |
| Tris base | Merck | T1503 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Urea | MP Biomedicals | 191450 | |
| Water bath | Nüve | NB 5 | For heat treatment of protein samples |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma | M6250 |
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