In vitro Charakterisierung von Histon-Chaperonen mittels analytischer, Pull-Down- und Chaperoning-Assays
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe von Methoden, die eine analytische Größenausschlusschromatographie zur Untersuchung der Histon-Chaperon-Oligomerisierung und -stabilität, den Pull-Down-Assay zur Entschlüsselung von Histon-Chaperon-Histon-Interaktionen, die AUC zur Analyse der Stöchiometrie der Proteinkomplexe und den Histon-Chaperoning-Assay zur funktionellen Charakterisierung eines mutmaßlichen Histon-Chaperons in vitro umfassen.
Abstract
Histonproteine assoziieren mit DNA, um das eukaryotische Chromatin zu bilden. Die Grundeinheit von Chromatin ist ein Nukleosom, das aus einem Histon-Oktamer besteht, das aus zwei Kopien der Kernhistone H2A, H2B, H3 und H4 besteht, die von der DNA umwickelt sind. Das Oktamer besteht aus zwei Kopien eines H2A/H2B-Dimers und einer einzigen Kopie eines H3/H4-Tetramers. Die hochgeladenen Kernhistonen neigen zu unspezifischen Wechselwirkungen mit mehreren Proteinen im zellulären Zytoplasma und im Zellkern. Histon-Chaperone bilden eine vielfältige Klasse von Proteinen, die Histone aus dem Zytoplasma in den Zellkern transportieren und deren Ablagerung auf der DNA unterstützen, wodurch der Nukleosomenzusammenbauprozess unterstützt wird. Einige Histonchaperone sind spezifisch für H2A / H2B oder H3 / H4, und einige fungieren als Chaperone für beide. Dieses Protokoll beschreibt, wie In-vitro-Labortechniken wie Pull-Down-Assays, analytische Größenausschlusschromatographie, analytische Ultrazentrifugation und Histon-Chaperoning-Assay zusammen verwendet werden können, um zu bestätigen, ob ein bestimmtes Protein als Histon-Chaperon funktionsfähig ist.
Introduction
Nukleosomen, die aus DNA und Histonproteinen bestehen, bilden die strukturelle Einheit des Chromatins und regulieren mehrere kritische zelluläre Ereignisse. Nukleosomen werden dynamisch neu positioniert und umgestaltet, um DNA für verschiedene Prozesse wie Replikation, Transkription und Translation zugänglich zu machen 1,2. Sehr basische Histone neigen entweder dazu, mit sauren Proteinen im zellulären Milieu zu interagieren oder eine Aggregation zu durchlaufen, was zu verschiedenen zellulären Defekten führt 3,4,5. Eine Gruppe von dedizierten Proteinen, die Histon-Chaperone genannt werden, unterstützen den Transport von Histonen aus dem Zytoplasma zum Zellkern und verhindern aberrante Histon-DNA-Aggregationsereignisse 6,7. Grundsätzlich speichern und übertragen die meisten Histon-Chaperone Histone mit physiologischer Ionenstärke auf DNA, wodurch die Bildung von Nukleosomen unterstütztwird 8,9. Einige Histon-Chaperone haben eine deutliche Vorliebe für die Histon-Oligomere H2A/H2B oder H3/H410.
Histon-Chaperone werden aufgrund ihrer Fähigkeit charakterisiert, Nukleosomen abhängig oder unabhängig von der DNA-Synthesezu bilden 11. Zum Beispiel ist der Chromatin-Assemblierungsfaktor-1 (CAF-1) abhängig, während der Histonregulator A (HIRA) unabhängig von der DNA-Synthese12,13 ist. In ähnlicher Weise ist die Nukleoplasmin-Familie der Histon-Chaperone an der Spermienchromatin-Dekondensation und der Nukleosomenmontage beteiligt14. Die Mitglieder der Nukleosomen-Assemblierungsprotein-Familie (NAP) erleichtern die Bildung nukleosomenähnlicher Strukturen in vitro und sind am Pendeln von Histonen zwischen Zytoplasma und Kern15 beteiligt. Nukleoplasmine und Proteine der NAP-Familie sind beide funktionelle Histon-Chaperone, haben aber keine strukturellen Merkmale. Im Wesentlichen erlaubt kein einzelnes strukturelles Merkmal die Klassifizierung eines Proteins als Histon-Chaperon16. Die Verwendung von funktionellen und biophysikalischen Assays zusammen mit Strukturstudien funktioniert am besten bei der Charakterisierung von Histon-Chaperonen.
Diese Arbeit beschreibt biochemische und biophysikalische Methoden zur Charakterisierung eines Proteins als Histon-Chaperon, das die Nukleosomenbildung unterstützt. Zunächst wurde eine analytische Größenausschlusschromatographie durchgeführt, um den oligomeren Status und die Stabilität von Histon-Chaperonen zu analysieren. Als nächstes wurde ein Pull-Down-Assay durchgeführt, um die treibenden Kräfte und den Wettbewerbscharakter von Histon-Chaperon-Histon-Interaktionen zu bestimmen. Die hydrodynamischen Parameter dieser Wechselwirkungen konnten jedoch nicht genau mit der analytischen Größenausschlusschromatographie berechnet werden, da die Form des Proteins und seine Komplexe ihre Migration durch die Säule beeinflussen. Daher wurde eine analytische Ultrazentrifugation verwendet, die in Lösung makromolekulare Eigenschaften liefert, die ein genaues Molekulargewicht, die Stöchiometrie der Wechselwirkung und die Form der biologischen Moleküle umfassen. Frühere Studien haben ausgiebig In-vitro-Histon-Chaperoning-Assays verwendet, um Histon-Chaperone wie yScS116 17, DmACF 18, ScRTT106p 19, HsNPM120 funktionell zu charakterisieren. Der Histon-Chaperoning-Assay wurde auch verwendet, um die Proteine funktionell als Histon-Chaperone zu charakterisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Arbeit demonstriert und validiert einen umfassenden Satz von Protokollen für die biochemische und biophysikalische Charakterisierung eines mutmaßlichen Histon-Chaperons. Hier wurden rekombinant exprimierte und gereinigte Proteine der NAP-Familie, AtNRP1 und AtNRP2, und die N-terminale Nukleoplasmindomäne von AtFKBP53 verwendet, um die Protokolle zu demonstrieren. Die gleiche Reihe von Experimenten könnte sehr gut verwendet werden, um die funktionellen Eigenschaften von bisher nicht charakterisierten Histon-Chap…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die außerordentlichen Zuschüsse an Dileep Vasudevan vom Science and Engineering Research Board, Government of India [CRG/2018/000695/PS] und dem Department of Biotechnology, Ministry of Science and Technology, Government of India [BT/INF/22/SP33046/2019], sowie die interne Unterstützung durch das Institute of Life Sciences, Bhubaneswar, werden sehr gewürdigt. Wir danken Frau Sudeshna Sen und Frau Annapurna Sahoo für ihre Hilfe bei der Histonvorbereitung. Die Gespräche mit unseren Kollegen Dr. Chinmayee Mohapatra, Manas Kumar Jagdev und Dr. Shaikh Nausad Hossain werden ebenfalls gewürdigt.
Materials
| Acetic acid (glacial) | Sigma | A6283 | |
| Acrylamide | MP Biomedicals | 814326 | |
| Agarose | MP Biomedicals | 193983 | |
| AKTA Pure 25M FPLC | Cytiva | 29018226 | Instrument for protein purification |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma | A3678 | |
| An-60Ti rotor | Beckman Coulter | 361964 | Rotor for analytical ultracentrifugation |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Coomassie brilliant blue R 250 | Sigma | 1.15444 | |
| Dialysis tubing (7 kDa cut-off) | Thermo Fisher | 68700 | For dialysing protein samples |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals | 100597 | |
| DNA Loading Dye | New England Biolabs | B7025S | |
| EDTA disodium salt | MP Biomedicals | 194822 | |
| Electronic balance | Shimadzu | ATX224R | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | |
| Ethidium bromide (EtBr) | Sigma | E8751 | |
| Gel Doc System | Bio-Rad | 12009077 | For imaging gels after staining |
| Horizontal gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 1704405 | Instrument for agarose gel electrophoresis |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | 320331 | |
| Imidazole | MP Biomedicals | 102033 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
| Micropipettes | Eppendorf | Z683779 | For pipetting of micro-volumes |
| Mini-PROTEAN electrophoresis system | Bio-Rad | 1658000 | Instrument for SDS-PAGE |
| N,N-methylene-bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800172 | |
| Nano drop | Thermo Fisher | ND-2000 | For measurement of protein and DNA concentrations |
| Ni-NTA agarose | Invitrogen | R901-15 | Resin beads for pull-down assay |
| Optima AUC analytical ultracentrifuge | Beckman Coulter | B86437 | Instrument for analytical ultracentrifugation |
| pH Meter | Mettler Toledo | MT30130863 | |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Plasmid isolation kit | Qiagen | 27104 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 1.07393 | |
| pUC19 | Thermo Fisher | SD0061 | Plasmid for supercoiling assay |
| Refrigerated high-speed centrifuge | Thermo Fisher | 75002402 | |
| SDS-PAGE protein marker | Bio-Rad | 1610317 | |
| SEDFIT | Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis | ||
| SEDNTERP | Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein | ||
| SigmaPrep Spin Columns | Sigma | SC1000 | For pull-down assay |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | S9888 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | MP Biomedicals | 102918 | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
| Superdex 75 Increase 10/300 GL | Cytiva | 29148721 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
| TEMED | Sigma | 1.10732 | |
| Topoisomerase I | Inspiralis | WGT102 | Enzyme used in plasmid supercoiling assay |
| Tris base | Merck | T1503 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Urea | MP Biomedicals | 191450 | |
| Water bath | Nüve | NB 5 | For heat treatment of protein samples |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma | M6250 |
Referenzen
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