المجهر الفلوري ثلاثي الفوتون للأنسجة العميقة في دماغ الفأر وسمك الزرد السليم
Summary
يتيح الفحص المجهري ثلاثي الفوتونات التصوير الفلوري عالي التباين في عمق الأنسجة البيولوجية الحية، مثل أدمغة الفئران وأسماك الزرد، بدقة مكانية زمانية عالية.
Abstract
تعد تقنيات الفحص المجهري متعدد الفوتونات ، مثل المجهر ثنائي الفوتون (2PM) والمجهر ثلاثي الفوتونات (3PM) ، أدوات قوية للتصوير العميق للأنسجة في الجسم الحي بدقة دون الخلايا. 3PM له ميزتان رئيسيتان لتصوير الأنسجة العميقة على مدار 2 مساء والتي تم استخدامها على نطاق واسع في مختبرات الأحياء: (i) طول التوهين الأطول في الأنسجة المبعثرة عن طريق استخدام ~ 1,300 نانومتر أو ~ 1,700 نانومتر ليزر الإثارة. (ii) توليد تألق أقل في الخلفية بسبب الإثارة غير الخطية ذات الترتيب الأعلى. ونتيجة لذلك ، يسمح 3PM بالتصوير الهيكلي والوظيفي عالي التباين في عمق الأنسجة المتناثرة مثل دماغ الفأر السليم من الطبقات القشرية إلى الحصين والدماغ الأمامي بأكمله لأسماك الزرد البالغة.
اليوم ، تتوفر مصادر الليزر المناسبة ل 3PM تجاريا ، مما يتيح تحويل نظام تصوير حالي ثنائي الفوتون (2P) إلى نظام ثلاثي الفوتون (3P). بالإضافة إلى ذلك ، تتوفر العديد من المجاهر التجارية 3P ، مما يجعل هذه التقنية متاحة بسهولة لمختبرات أبحاث علم الأحياء. تظهر هذه الورقة تحسين إعداد 3PM النموذجي ، خاصة استهداف مجموعات البيولوجيا التي لديها بالفعل إعداد 2P ، وتوضح التصوير ثلاثي الأبعاد داخل الحيوية في أدمغة الفئران وأسماك الزرد البالغة السليمة. يغطي هذا البروتوكول الإجراء التجريبي الكامل للتصوير ثلاثي الأبعاد ، بما في ذلك محاذاة المجهر ، والنقيق المسبق لنبضات الليزر ~ 1,300 و ~ 1,700 نانومتر ، وإعداد الحيوانات ، والتصوير الفلوري 3P داخل الحيوية في عمق أزهار الزرد والفئران البالغة.
Introduction
في علوم الحياة ، كانت تقنيات الفحص المجهري متعدد الفوتونات (MPM) ، مثل 2PM و 3PM ، أدوات قوية للتصوير العميق في الجسم الحي بدقة مكانية زمانية عالية وتباين عال في الأنسجة المبعثرة. بالإضافة إلى ذلك ، تسبب هذه الطرق تبييضا ضوئيا أقل عند مقارنتها بالمجهر البؤري بفوتون واحد1،2،3،4. يعد 3PM مفيدا لتصوير الأنسجة العميقة عند مقارنته ب 2PM بسبب ميزتين رئيسيتين: (i) استخدام إثارة الطول الموجي الأطول (~ 1,300 nm أو ~ 1,700 nm) يقلل من تشتت الأنسجة ، و (ii) عملية الإثارة ذات الترتيب الأعلى (أي أن إشارة التألق تعتمد على مكعب قوة الإثارة في 3PM بدلا من مربع قوة الإثارة في 2PM) التي تمنع التألق الخلفية غير المرغوب فيه3 . وبالتالي ، يتيح 3PM التصوير عالي التباين في المناطق العميقة في الأنسجة الحية مثل الحصين في دماغ فأر بالغ سليم3،5،6،7،8،9،10،11 والدماغ الأمامي بأكمله من الزرد البالغ 12 ، بما في ذلك Ca2 + تسجيل النشاط والملاحظات متعددة الألوان. علاوة على ذلك ، تم الحصول على صور عالية التباين مع 3PM من خلال الجماجم السليمة للفئران وأسماك الزرد البالغة12,13.
اليوم ، تتوفر مصادر ليزر الإثارة المناسبة لإثارة 3P (3PE) عند ~ 1,300 و ~ 1,700 نانومتر تجاريا. نظرا لأن نظام المسح الضوئي بالليزر هو نفسه في الأساس في 2PM و 3PM ، فإن تحويل إعداد 2P الحالي إلى إعداد 3P ممكن في مختبرات البيولوجيا مع تركيب ليزر متاح تجاريا ل 3PE. تعتمد إشارة التألق 3P على طاقة الليزر ومدة النبض ومعدل تكرار الليزر والفتحة العددية (NA) للعدسة الموضوعية. بافتراض التركيز البؤري المحدود بالحيود (أي أن الفتحة الخلفية للعدسة الموضوعية ممتلئة بشعاع الإثارة) ، يصف Eq (1) تدفق فوتون التألق في المتوسط الزمني من الحجم البؤري الناتج عن 3PE.
(1)
حيث f هو معدل تكرار الليزر ، τ هو مدة نبضة الليزر (العرض الكامل عند نصف الحد الأقصى) ، φ هو كفاءة جمع النظام ، η هو الكفاءة الكمومية الفلورية ، σ3 هو المقطع العرضي لامتصاص 3P ، C هو تركيز الفلوروفور ، n0 هو المؤشر العاكس لوسط العينة (على سبيل المثال ، الماء) ، λ هو الطول الموجي للإثارة في الفراغ ، NA هي الفتحة العددية للعدسة الموضوعية ، و 3 هي ثابت التكامل المكاني للحجم البؤري ، وهي تدفق فوتون الإثارة المتوسط زمنيا (الفوتونات / الفوتونات) تحت العدسة الموضوعية ، z هو العمق المصور ، 
و EAL هو طول التوهين الفعال14. هنا افترضنا أن EAL (عادة > 100 ميكرومتر) أكبر بكثير من الدقة المحورية للمجهر (عادة < 10 ميكرومتر). تحت التقريب الباراكسي ، يساوي3 28.114. g p(3) هو التماسك الزمني من الدرجة الثالثة لمصدر الإثارة ، و g p(3) هو 0.41 و 0.51 للنبضات المربعة القاطعة المفرطة والنبضات الغاوسية ، على التوالي. يمكن تقدير كفاءة الجمع φ من خلال النظر في جمع التألق بواسطة العدسة الموضوعية ، ونفاذية العدسة الموضوعية ، وانعكاسية المرآة ثنائية اللون ، ونفاذية المرشحات ، وكفاءة الكشف عن الكاشف (على سبيل المثال ، أنبوب المضاعف الضوئي ، أو PMT). نظرا لأن كثافة التألق 3P تعتمد بشكل كبير على معلمات مختلفة ، فإن تحسين إعداد 3P مطلوب لزيادة إشارات التألق 3P إلى أقصى حد.
يوضح هذا البروتوكول عملية التحسين لإعداد 3P النموذجي ، والذي سيكون مفيدا بشكل خاص لمختبرات البيولوجيا التي لديها إعداد 2P وتخطط لتوسيع قدرتها على التصوير 3P أو للحفاظ على إعداد 3P التجاري الخاص بها في الأداء الأمثل. توضح مقالة الفيديو هذه أيضا تصوير 3P للأنسجة العميقة في أدمغة الحيوانات الحية. يتناول القسم الأول تحسين إعداد 3P النموذجي باستخدام مصدر ليزر متاح تجاريا ومجهر متعدد الفوتونات. يصف القسمان الثاني والثالث إعداد الزرد والفأر ، على التوالي ، ل 3PM من الهياكل والأنشطة العصبية. تم الإبلاغ عن جراحة استئصال القحف بالفئران سابقا في أوراق البروتوكول وكذلك 15،16،17. يوضح القسم الرابع التصوير 3P داخل الحيوية في أدمغة الزرد والفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
يشرح هذا البروتوكول الإجراءات خطوة بخطوة لإعداد التصوير 3P باستخدام المجهر التجاري ومصدر الليزر. بالمقارنة مع 2PM ، تتمتع 3PM بميزة في التطبيقات التي تتطلب الوصول البصري في المناطق العميقة مثل الحصين في دماغ الماوس. على الرغم من أن 3PM يستخدم في الغالب في علم الأعصاب ، إلا أنه يمكن تطبيق 3PM في أنسجة أخرى مثل الغدد الليمفاوية والعظام والأورام لمراقبة الأنسجة العميقة.
من المهم التحقق من أن نظام التصوير يعمل بالقرب من حد ضوضاء اللقطة ، مما يضمن أن إلكترونيات الكشف والحصول على البيانات تساهم بضوضاء ضئيلة في الصورة بعد PMTs. إن عدم اليقين في عدد الفوتونات المكتشفة محدود بشكل أساسي بسبب ضوضاء الفوتون الملتقطة. يمكن تحقيق أداء محدود لضوضاء اللقطة في مجهر نموذجي متعدد الفوتونات باستخدام كاشف ضوئي عالي الكسب (على سبيل المثال ، PMT). تتبع ضوضاء لقطة الفوتون توزيعا إحصائيا لبواسون ، حيث يكون الانحراف المعياري للتوزيع مساويا للجذر التربيعي لمتوسط التوزيع. للتحقق من الأداء المحدود لضوضاء اللقطة، اتبع الخطوة 1.14 في قسم البروتوكول.
لتجنب توهين الضوء بواسطة H 2 O ،يعد استخدام D2O للغمر مفيدا ، خاصة بالنسبة للإثارة ~ 1,700 نانومتر. عند استخدام D 2 O ، من الضروري تحديث D 2 O كل 10 دقائق تقريبا أو استخدام حجم كبير من D 2 O لتجنب تبادل D 2 O / H2Oأثناء التصوير. يمكن للمرء أيضا إغلاق D2O من بيئة الغرفة3. إذا تم استخدام عدسة موضوعية لمسافة العمل الطويلة (WD) (على سبيل المثال، WD عند 4 مم أو أكثر) للتصوير، فقد يتجاوز سمك سائل الغمر 2-3 مم. زيادة سمك يجعل امتصاص H2O لا يستهان به حتى عند ~ 1300 نانومتر21. لذلك ، قد يكون D2O ضروريا حتى بالنسبة ل 1300 نانومتر 3 مساء عند استخدام عدسة WD موضوعية طويلة.
نظرا لأن شدة التألق 3P تعتمد على مكعب طاقة نبض الإثارة عند التركيز (Eq. (1)) ، فإن ضبط طاقة الليزر المناسبة مهم بشكل خاص للحصول على إشارات فلورية 3P كافية مع تجنب التلف الحراري وغير الخطي في الأنسجة الحية. يجب أن يبقى متوسط طاقة الليزر أقل من عتبة الضرر الحراري. في دماغ الفأر ، على سبيل المثال ، لتجنب تلف الأنسجة الحرارية ، يجب الاحتفاظ بمتوسط الطاقة على سطح دماغ الفأر عند أو أقل من ~ 100 mW لإثارة ~ 1,300 nm على عمق 1 mm ومع مجال رؤية (FOV) من 230 ميكرومتر × 230 ميكرومتر21. وبالمثل ، يجب الاحتفاظ بمتوسط الطاقة عند ~ 1700 نانومتر عند أو أقل من ~ 50 ميجاوات على عمق ~ 1 مم و FOV ~ 230 ميكرومتر × 230 ميكرومتر (بيانات غير منشورة). علاوة على ذلك ، لتجنب تشبع الإثارة والضرر غير الخطي المحتمل ، يجب الاحتفاظ بطاقة نبض الإثارة عند 
2 نانوجول و 3 نانوجول ل ~ 1300 نانومتر و ~ 1700 نانومتر إثارة ، على التوالي30.
بسبب امتصاص الضوء والتشتت في الأنسجة ، يتم تخفيف طاقة النبض في التركيز إلى 1 / e (~ 37 ٪) بعد اختراق الأنسجة بواسطة 1 EAL. يختلف EAL في الأنسجة المختلفة ومع الأطوال الموجية للإثارة ، على سبيل المثال ، في القشرة المخية الجديدة لدماغ الفأر ، يكون EAL ~ 300 ميكرومتر و ~ 400 ميكرومتر عند ~ 1,300 نانومتر و ~ 1,700 نانومتر ، على التوالي 3,29 (الشكل 5). لذلك ، للحفاظ على نفس طاقة النبض في التركيز (على سبيل المثال ، 1 nJ / pulse) على عمق n EALs ، يجب ضرب طاقة النبض السطحي في 1 nJ × en. للتصوير السريع للديناميكيات الهيكلية والوظيفية ، من المستحسن استخدام ليزر الإثارة بمعدل تكرار مرتفع (عند 1 ميجاهرتز أو أعلى) لتحقيق معدل إطارات مرتفع5،6،7،10. ومع ذلك ، فإن متطلبات طاقة النبض ومتوسط حد طاقة الليزر يقيدان معدل التكرار المعمول به.
على سبيل المثال ، عندما نصور منطقة عميقة بشكل معتدل عند 4 EALs (أي ~ 1.2 مم في قشرة الماوس مع إثارة 1300 نانومتر) ، يلزم ~ 55 نانوجول / نبضة على السطح للحفاظ على 1 نانوجول / نبضة في التركيز. عندما يكون متوسط الحد من الطاقة 100 ميجاوات ، يمكننا تطبيق معدل تكرار ليزر ~ 2 ميجاهرتز. ومع ذلك ، للحصول على صورة أعمق على عمق 7 EALs ، يلزم وجود 1100 nJ / نبضة على السطح للحفاظ على 1 nJ / pulse عند التركيز. بافتراض أن الحد الأقصى لمتوسط الطاقة هو 100 ميجاوات لتجنب التلف الحراري ، يجب تقليل معدل تكرار الليزر إلى 0.1 ميجاهرتز لتحقيق نبضة 1,100 nJ / على السطح. يلخص الجدول 1 ظروف التصوير النموذجية في قشرة دماغ الفأر. لاحظ أن أعماق التصوير في الجدول 1 تفترض أن EAL موحد في قشرة الفأر بأكملها.
علاوة على ذلك ، بسبب الحد من طاقة الليزر في الأنسجة العميقة 3PM ، توجد مفاضلة بين معدل الإطارات وحجم بكسل الصورة ، وهو أمر مهم بشكل خاص للتصوير الوظيفي مثل تصوير الكالسيوم. يتم تحديد الحد الأقصى لمعدل تكرار الليزر المتاح في كل عمق بناء على طاقة النبض المطلوبة عند التركيز ومتوسط طاقة الليزر المعمول بها كما نوقش أعلاه ، على سبيل المثال ، 2 ميجاهرتز على عمق يعادل ~ 4 EALs مع إثارة 1300 نانومتر. بشكل عام ، يتطلب التصوير نبضة واحدة على الأقل لكل بكسل. وبناء على ذلك، يتم تحديد الحد الأدنى من وقت بقاء البكسل المتاح من خلال معدل تكرار الليزر، على سبيل المثال، 0.5 ميكروثانية/بكسل مع إثارة 2 ميغاهرتز.
للحفاظ على الدقة المكانية العالية (~ 1 ميكرومتر في الجانبية) في صور 3P ، من المثالي تعيين 1 بكسل على مساحة ~ 1 ميكرومتر 2 ، على سبيل المثال ، 256 × 256 بكسل ل FOV من 250 × 250 ميكرومتر2. وبالتالي ، لإجراء تصوير سريع باستخدام FOV كبير إلى حد كبير (على سبيل المثال ، 250 × 250 ميكرومتر 2 مع 256 × 256 بكسل) ، فإن معدلات تكرار النبض 0.5 ميجاهرتز و 1 ميجاهرتز و2 ميجاهرتز تعطي معدلات الإطارات القصوى النظرية ~ 7.6 و ~ 15 و ~ 30 إطارا / ثانية ، على التوالي. وبالمثل ، فإن تحسين معدل تكرار الليزر أمر ضروري ، اعتمادا على العمق المستهدف ، وسرعة المسح الضوئي ، و FOV ، لتطبيق طاقة نبض كافية تحت عتبة الضرر الحراري. لزيادة سرعة التصوير ، يمكن استخدام مصدر الإثارة التكيفي لتركيز جميع نبضات الإثارة على الخلايا العصبية (أي المناطق ذات الاهتمام) عن طريق توصيل نبضات الليزر عند الطلب إلى الخلايا العصبية31.
يعد 3PM مفيدا عند مقارنته ب 2PM في التصوير العميق داخل الأنسجة الحية ومن خلال وسائط مبعثرة للغاية مثل الجمجمة والعظام وطبقة المادة البيضاء (أي الكبسولة الخارجية) لدماغ الفأر. كلما طالت EAL والإثارة غير الخطية ذات الترتيب الأعلى ل 3PE تفيد تصوير الأنسجة العميقة. على سبيل المثال ، لتصوير GCaMP6 في قشرة الماوس ، تكون إشارة التألق 2P مع إثارة 920 نانومتر أعلى من إشارة التألق 3P مع إثارة 1300 نانومتر في المناطق الضحلة عند 690 ميكرومتر (أي ~ 2.3 EALs عند 1300 نانومتر)21. ومع ذلك ، نظرا لطول EAL عند 1300 نانومتر مقارنة ب 920 نانومتر ، فإن 3PE يعطي تألقا أقوى من إثارة 2P (2PE) على عمق ~ 690 ميكرومتر وأعمق21. يتم تعريف هذا العمق على أنه “عمق تقاطع الإشارة” ، حيث تكون قوة إشارة التألق 2PE و 3PE متطابقة مع نفس معدل التكرار ونفس الحد الأقصى المسموح به متوسط القوى21. يعتمد عمق تقاطع الإشارة على الأطوال الموجية للإثارة ل 2PE و 3PE والفلوروفور.
في الممارسة العملية ، تسمح الإثارة 920 نانومتر بمتوسط طاقة ليزر أعلى من إثارة 1300 نانومتر بسبب امتصاص الماء الأقل. ومع ذلك ، فإن متوسط الطاقة الأعلى ل 2PE سيدفع عمق تقاطع الإشارة فقط بمقدار 0.9 EALs4. بالإضافة إلى ذلك ، عندما يتم تصنيف العينة بكثافة ، فإن 3PE لديه ميزة إضافية تتمثل في SBR أعلى بكثير. لذلك ، حتى قبل الوصول إلى طول تقاطع الإشارة ، يمكن أن يكون 3PM أفضل للتصوير من 2PM. على سبيل المثال ، عند تصوير الأوعية الدموية لدماغ الماوس ، والتي تحتوي على جزء حجمي (أي كثافة وضع العلامات) تبلغ ~ 2٪ ، فإن 1,300 نانومتر 3PM مع قوة إثارة 100 ميجاوات تتفوق على 920 نانومتر 2 مساء مع قوة إثارة 200 ميجاوات على عمق ~ 700 ميكرومتر للفلوريسين.
تتمتع 3PM أيضا بميزة عند التصوير من خلال طبقة رقيقة ولكنها مبعثرة للغاية قد تشوه وظيفة انتشار النقاط لشعاع الإثارة وتولد خلفية إلغاء التركيزالبؤري 4. على سبيل المثال ، من خلال الجمجمة السليمة لدماغ الفأر ، تعاني صور 2PM من خلفية إلغاء التركيز البؤري حتى على عمق ضحل يبلغ <100 ميكرومتر من سطح الدماغ13. لوحظت خلفية مماثلة لإلغاء التركيز البؤري في الساعة 2 مساء مع إثارة 1,280 نانومتر من خلال المادة البيضاء في دماغ الفأر32. لذلك ، عندما يتم تصوير الأنسجة من خلال طبقات عكرة ، يفضل 3PM على 2PM للتصوير عالي التباين بغض النظر عن كثافة وضع العلامات.
لقد أبلغنا مؤخرا عن تحليل وهمي ونظري للخرز يوضح أن حد عمق التصوير في الساعة 3 مساء يزيد عن 8 EALs33 ؛ 8 EALs تعادل ~ 3 مم مع إثارة ~ 1700 نانومتر في قشرة الماوس. ومع ذلك ، فإن الليزر المتاح حاليا لا يحتوي على طاقة نبضية كافية لتحقيق 8 EALs في دماغ الماوس. مزيد من التطوير لليزر أقوى سيدفع الحد الأقصى لعمق التصوير الحالي البالغ 3 مساء.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub و NIH 1U01NS103516.
Materials
| 5% Povidone-iodine | Amazon | NDC 67818-155-32 | Aceptical cleaning of surgical areas |
| 70% Ethanol | Thermo Fisher Scientific | CAS 64-17-5 | Aceptical cleaning of surgical areas |
| Agarose | Sigma | A4718-256 | Preparing zebrafish chamber |
| Atropine | Cornell Veterinary Care | ||
| Bergamo II | Thorlabs | Multiphoton Imaging Microscope | |
| Bupivacaine | Cornell Veterinary Care | ||
| Dexamethasone | Cornell Veterinary Care | ||
| Donut shape glass (ID4.5, OD6.5) | Potomac Photonics | Cover glass used for craniotomy | |
| eye ointment (or topical ophthalmic ointment) | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia |
| GaAsP Amplified PMT | Thorlabs | PMT2100 | PMT detector |
| Glucose | Cornell Veterinary Care | ||
| Glycopyrrolate | Cornell Veterinary Care | ||
| Heater (800 W) | Finnex | Aquarium heater for zebrafish water) | |
| Isoflurane USP 250 mL | Piramal | NDC 66794-0013-25 | For anesthesia of mice |
| Ketoprofen | Cornell Veterinary Care | ||
| Kimwipes | Kimtech | Laboratory tissue for preparing zebrafish | |
| Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle | WPI | NANOFIL + NF36BV | Syringe and needle for injection of pancuronium bromide |
| Optical Adhesive | Norland | NOA 68 | To stick round coverslip and donut shape glass together. |
| Pancuronium Bromide | Cornell Veterinary Care | ||
| Peristaltic Pump | Elemental Science | ESI MP2 | Water pump for zebrafish setup |
| Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.) | Elemental Science | MP2 pump tubing | Tubing that goes in the mouth of the zebrafish |
| Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm | Electron Microscopy Sciences | 7229605 | Cover glass used for craniotomy |
| Spirit-NOPA | Spectra Physics | Tunable Optical Parametric Amplifier | |
| SR400 | Stanford Research Systems | SR400 | Photon counter |
| Standard Photodiode Power Sensor | Thorlabs | S122C | Power detector |
| Sterilized phosphate buffered saline (PBS) | Millipore Sigma | SKU 806552-500ml | Used during mouse brain surgery |
| Surgical drape | Dynarex disposable towel drape | 4410 | For aceptical mouse surgery |
| Thin strip boxing wax | Corning Rubber Co., Inc. | Holding tubing in place in zebrafish chamber | |
| ThorImage | Thorlabs | Image acquisition software | |
| Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt) | MP | 103106 | Zebrafish anesthesia and euthanasia |
| Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.) | Tygon | Tubing for water flow for zebrafish preparation | |
| VaporGuard | VetEquip | 931401 | For recycling isoflurane |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish. |
| XLPLN25XWMP2 | Olympus | Multiphoton Excitation Dedicated Objective |
Referenzen
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).
- Wang, T., Xu, C. Three-photon neuronal imaging in deep mouse brain. Optica. 7 (8), 947-960 (2020).
- Ouzounov, D. G., et al. In vivo three-photon imaging of activity of GCaMP6-labeled neurons deep in intact mouse brain. Nature Methods. 14 (4), 388-390 (2017).
- Weisenburger, S., et al. Volumetric Ca2+ imaging in the mouse brain using hybrid multiplexed sculpted light microscopy. Cell. 177 (4), 1050-1066 (2019).
- Yildirim, M., Sugihara, H., So, P. T. C., Sur, M. Functional imaging of visual cortical layers and subplate in awake mice with optimized three-photon microscopy. Nature Communications. 10, 177 (2019).
- Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain. eNeuro. 7 (1), (2020).
- Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light, Science & Applications. 7, 12 (2018).
- Hontani, Y., Xia, F., Xu, C. Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain. Science Advances. 7 (12), 3531 (2021).
- Liu, H., et al. In vivo deep-brain structural and hemodynamic multiphoton microscopy enabled by quantum dots. Nano Letters. 19 (8), 5260-5265 (2019).
- Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
- Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
- Xu, C., Webb, W. W. Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy. Topics in Fluorescence Spectroscopy. 5. , 471-540 (2002).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (12), e680 (2008).
- Łukasiewicz, K., Robacha, M., Bożycki, &. #. 3. 2. 1. ;., Radwanska, K., Czajkowski, R. Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53528 (2016).
- Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e52642 (2017).
- Gordon, J. P., Martinez, O. E., Fork, R. L. Negative dispersion using pairs of prisms. Optics Letters. 9 (5), 150-152 (1984).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Horton, N. G., Xu, C. Dispersion compensation in three-photon fluorescence microscopy at 1,700 nm. Biomedical Optics Express. 6 (4), 1392-1397 (2015).
- Wang, T., et al. Quantitative analysis of 1300-nm three-photon calcium imaging in the mouse brain. eLife. 9, 53205 (2020).
- Cheng, L. -. C., Horton, N. G., Wang, K., Chen, S. -. J., Xu, C. Measurements of multiphoton action cross sections for multiphoton microscopy. Biomedical Optics Express. 5 (10), 3427-3433 (2014).
- Huang, K. -. H., et al. A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish. Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).
- Jacobson, G. A., Rupprecht, P., Friedrich, R. W. Experience-dependent plasticity of odor representations in the telencephalon of zebrafish. Current Biology. 28 (1), 1-14 (2018).
- Li, J., et al. Early development of functional spatial maps in the zebrafish olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 25 (24), 5784-5795 (2005).
- Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
- Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
- Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
- Wang, M., Wu, C., Sinefeld, D., Li, B., Xia, F., Xu, C. Comparing the effective attenuation lengths for long wavelength in vivo imaging of the mouse brain. Biomedical Optics Express. 9 (8), 3534-3543 (2018).
- Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Applied Physics B. 81 (8), 1015-1047 (2005).
- Li, B., Wu, C., Wang, M., Charan, K., Xu, C. An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy. Nature Methods. 17 (2), 163-166 (2019).
- Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106014 (2011).
- Akbari, N., Rebec, M. R., Xia, F., Xu, C. Imaging deeper than the transport mean free path with multiphoton microscopy. Biomedical Optics Express. 13, 452-463 (2022).
