В пробирке Медикаментозный скрининг на всех стадиях жизненного цикла Trypanosoma cruzi с использованием паразитов, экспрессирующих β-галактозидазу

Болезнь Шагаса (ChD), или американский трипаносомоз, является паразитарным заболеванием, вызванным жгутиковым простейшим, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). ИБС начинается с бессимптомной или олигосимптомной острой фазы, которая обычно не диагностируется, за которой следует пожизненная хроническая фаза. При хроничности ~ 30% пациентов проявляются через десятилетия после заражения различные изнурительные состояния, включая миокардиопатию, мега-пищеварительные синдромы или и то, и другое, с коэффициентом смертности от 0,2% до 20%^1,2,3. Бессимптомные хронические пациенты могут не иметь клинических признаков, но оставаться серопозитивными на протяжении всей своей жизни.

Оценки показывают, что ~ 7 миллионов человек инфицированы во всем мире, в основном из Латинской Америки, где ИБС является эндемичным. В этих странах T. cruzi в основном передается через инфицированных кровососущих триатоминовых насекомых (трансмиссивная передача) и реже перорально через прием пищи, загрязненной триатоминовыми фекалиями, содержащими паразитов². Кроме того, паразит может передаваться через плаценту от чагасических матерей новорожденным, через переливание крови или во время трансплантации органов. Эти независимые от переносчиков способы заражения инфекцией и миграции людей способствовали всемирному распространению болезни, о чем свидетельствует увеличение числа случаев заболевания в Северной Америке, Европе и некоторых странах Африки, Восточного Средиземноморья и Западной части Тихого^{океана4}. ИБС считается забытой болезнью, поскольку трансмиссивная передача тесно связана с нищетой и является ведущей проблемой общественного здравоохранения, особенно в странах Латинской Америки с низким уровнем дохода. Несмотря на наличие доступных методов лечения, смертность от ИБС в Латинской Америке является самой высокой среди паразитарных заболеваний, включая малярию².

Существует два зарегистрированных препарата для лечения ИБС, введенных в конце 1960-х и начале 1970-х годов: нифуртимокс и бензнидазол⁵. Оба препарата эффективны в острой фазе заболевания у взрослых, детей и врожденно инфицированных новорожденных, а также у детей с хронической инфекцией, где обычно достигается излечение. Тем не менее, только несколько человек диагностируются достаточно рано, чтобы вовремя лечиться. Согласно последним клиническим испытаниям, оба препарата имеют важные ограничения у взрослых и были неэффективны в уменьшении симптомов у людей с хроническими заболеваниями; следовательно, их использование на данном этапе является спорным. Другими недостатками являются длительные сроки лечения (60-90 дней) и наблюдаемые частые, тяжелые побочные эффекты, которые приводят к прекращению терапии у доли инфицированных людей ^6,7. По оценкам, менее 10% людей с ИБС были диагностированы, и еще меньше людей имеют доступ к лечению, поскольку многие пострадавшие люди живут в сельских районах без или с ограниченным доступом к здравоохранению⁸. Эти факты подчеркивают настоятельную необходимость поиска новых лекарств против T. cruzi, чтобы обеспечить более эффективные, безопасные и применимые к полевым методам лечения, особенно для хронической фазы. В связи с этим еще одной проблемой в разработке более эффективных соединений является ограничение систем оценки эффективности препарата in vitro и in vivo⁹.

Хотя химическая биология и геномные подходы для идентификации потенциальных мишеней лекарств использовались у кинетопластидных паразитов, доступные геномные инструменты у T. cruzi ограничены в отличие от T. brucei или Leishmania. Таким образом, скрининг соединений с трипаноцидной активностью по-прежнему является наиболее используемым подходом в поиске новых химиотерапевтических препаратов-кандидатов против ИПК. Обычно открытие препарата у T. cruzi должно начинаться с тестирования эффектов нового препарата в анализе in vitro против стадии эпимастигота. В течение десятилетий единственным способом измерения ингибирующего воздействия соединений-кандидатов на T. cruzi был ручной микроскопический подсчет, который является трудоемким, трудоемким и зависящим от оператора. Кроме того, этот подход подходит для анализа небольшого количества соединений, но неприемлем для высокопроизводительного скрининга больших библиотек соединений. В настоящее время многие исследования начинаются с анализа огромного количества соединений различного происхождения, которые анализируются in vitro, проверяя их способность ингибировать рост паразитов. Как колориметрические, так и флуорометрические методы были разработаны для увеличения пропускной способности в этих анализах, повышения объективности скрининга и делая весь процесс менее утомительным⁹.

Один из наиболее широко используемых колориметрических методов основан на β-галактозидазной активности трансфекторазных паразитов, впервые описанной Бакнетом и соавторами¹⁰. Фермент β-галактозидазы, экспрессируемый рекомбинантными паразитами, гидролизует хромогенный субстрат, хлорфенол красный β-D-галактопиранозид (CPRG), до хлорфенол-красного, который можно легко измерить колориметрически с помощью микропластичного спектрофотометра. Таким образом, рост паразитов в присутствии различных соединений может быть одновременно оценен и количественно определен в микротитрных пластинах. Этот метод был применен для тестирования лекарств в формах эпимастигот (присутствующих в насекомом переносчике), трипомастиготах и внутриклеточных амастиготах, стадиях млекопитающих паразита. Кроме того, несколько рекомбинантных штаммов T. cruzi, трансфектированных плазмидой pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 (pLacZ)¹⁰ для экспрессии фермента Escherichia coli β-галактозидазы, уже доступны (и могут быть построены новые), что позволяет оценивать паразитов из разных дискретных типографских единиц (DTU), которые могут не вести себя одинаково по отношению к одним и тем же соединениям 10,11,12,13 . Этот метод уже успешно использовался для оценки активности соединений в отношении T. cruzi при низко- и высокопроизводительном скрининге^12,13. Аналогичные подходы также использовались у других простейших паразитов, включая Toxoplasma gondii и Leishmania mexicana^14,15.

В этой статье описан и показан подробный метод скрининга препарата in vitro против всех стадий жизненного цикла T. cruzi с использованием паразитов, экспрессирующих β-галактозидазу. Представленные здесь анализы были выполнены с β-галактозидазой-экспрессирующей линией T. cruzi , полученной путем трансфекции штамма T. cruzi Dm28c из DTU I¹³ с плазмидой pLacZ (Dm28c/pLacZ). Кроме того, тот же протокол может быть легко адаптирован к другим штаммам для сравнения производительности между соединениями и между штаммами T. cruzi или DTU.