In vitro Drugsscreening tegen alle levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi met behulp van parasieten die β-galactosidase tot expressie brengen

De ziekte van Chagas (ChD), of Amerikaanse trypanosomiasis, is een parasitaire ziekte veroorzaakt door de flagellated protozoa, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). ChD begint met een asymptomatische of oligosymptomatische acute fase die meestal niet gediagnosticeerd is, gevolgd door een levenslange chronische fase. In de chroniciteit manifesteert ~ 30% van de patiënten zich – decennia na de infectie – een verscheidenheid aan slopende aandoeningen, waaronder myocardiopathie, mega-spijsverteringssyndromen of beide, met een sterftecijfer variërend van 0,2% tot 20% ^1,2,3. Asymptomatische chronische patiënten kunnen geen klinische symptomen hebben, maar blijven hun hele leven seropositief.

Schattingen suggereren dat ~ 7 miljoen mensen wereldwijd besmet zijn, meestal uit Latijns-Amerika, waar ChD endemisch is. In deze landen wordt T. cruzi voornamelijk overgedragen door geïnfecteerde bloedzuigende triatomine-insecten (vectoroverdracht) en minder vaak door orale overdracht door de inname van voedsel dat besmet is met triatomine-uitwerpselen die de parasieten bevatten². Bovendien kan de parasiet via de placenta worden overgedragen van chagasische moeders op pasgeborenen, via bloedtransfusies of tijdens orgaantransplantatie. Deze vectoronafhankelijke manieren om de infectie en menselijke migratie te verwerven, hebben bijgedragen aan de wereldwijde verspreiding van de ziekte, wat blijkt uit een toenemend aantal gevallen in Noord-Amerika, Europa en sommige Afrikaanse, oostelijke mediterrane en westelijke Pacifische landen⁴. ChD wordt beschouwd als een verwaarloosde ziekte omdat vectoroverdracht nauw verbonden is met armoede en een toonaangevend volksgezondheidsprobleem is, vooral in Latijns-Amerikaanse lage-inkomenslanden. Hoewel er beschikbare behandelingen zijn, is de mortaliteit als gevolg van ChD in Latijns-Amerika de hoogste onder parasitaire ziekten, waaronder malaria².

Er zijn twee geregistreerde geneesmiddelen voor ChD-behandeling geïntroduceerd in de late jaren 1960 en vroege jaren 1970: nifurtimox en benznidazol⁵. Beide geneesmiddelen zijn effectief in de acute fase van de ziekte bij volwassenen, kinderen en aangeboren geïnfecteerde pasgeborenen, evenals bij kinderen met een chronische infectie, waar genezing meestal wordt bereikt. Slechts een paar mensen worden echter vroeg genoeg gediagnosticeerd om op tijd te worden behandeld. Volgens de laatste klinische onderzoeken hebben beide geneesmiddelen belangrijke beperkingen bij volwassenen en waren ze niet effectief in het verminderen van symptomen bij mensen met een chronische ziekte; vandaar dat het gebruik ervan in deze fase controversieel is. Andere nadelen zijn de verlengde behandelingsperioden die nodig zijn (60-90 dagen) en de frequente, ernstige bijwerkingen die worden waargenomen, die leiden tot stopzetting van de behandeling bij een deel van de geïnfecteerde mensen ^6,7. Geschat wordt dat minder dan 10% van de mensen met ChD is gediagnosticeerd en nog minder hebben toegang tot behandeling, omdat veel getroffen personen op het platteland wonen met geen of nauwelijks toegang tot gezondheidszorg⁸. Deze feiten benadrukken de dringende noodzaak om nieuwe geneesmiddelen tegen T. cruzi te vinden om efficiëntere, veiligere en op het veld toepasbare behandelingen mogelijk te maken, vooral voor de chronische fase. In dit verband is een andere uitdaging bij de ontwikkeling van effectievere verbindingen de beperking van systemen voor het beoordelen van de werkzaamheid van geneesmiddelen in vitro en in vivo⁹.

Hoewel chemische biologie en genomische benaderingen voor de identificatie van potentiële geneesmiddeldoelen zijn gebruikt bij kinetoplastide parasieten, zijn de beschikbare genomische hulpmiddelen in T. cruzi beperkt in tegenstelling tot T. brucei of Leishmania. De screening van verbindingen met trypanocidale activiteit is dus nog steeds de meest gebruikte benadering in de zoektocht naar nieuwe chemotherapeutische kandidaat-geneesmiddelen tegen ChD. Gewoonlijk moet de ontdekking van geneesmiddelen in T. cruzi beginnen met het testen van de effecten van een nieuw geneesmiddel in een in vitro test tegen het epimastigotenstadium. Decennialang was de enige manier om de remmende effecten van kandidaat-verbindingen op T. cruzi te meten handmatig microscopisch tellen, wat arbeidsintensief, tijdrovend en operatorafhankelijk is. Bovendien is deze aanpak geschikt voor het testen van een klein aantal verbindingen, maar is onaanvaardbaar voor high-throughput screening van grote samengestelde bibliotheken. Tegenwoordig beginnen veel onderzoeken met de analyse van een groot aantal verbindingen van verschillende oorsprong die in vitro worden getest, waarbij hun vermogen om de groei van parasieten te remmen wordt getest. Zowel colorimetrische als fluorometrische methoden zijn ontwikkeld om de doorvoer in deze testen te verhogen, de objectiviteit van de screening te verbeteren en het hele proces minder vervelend te maken⁹.

Een van de meest gebruikte colorimetrische methoden is gebaseerd op de β-galactosidase-activiteit van getransfecteerde parasieten die voor het eerst werden beschreven door Bucknet en medewerkers¹⁰. Het β-galactosidase-enzym dat tot expressie wordt gebracht door de recombinante parasieten hydrolyseert het chromogene substraat, chloorfenolrood β-D-galactopyranoside (CPRG), tot chloorfenolrood, dat gemakkelijk colorimetrisch kan worden gemeten met behulp van een microplaatspectrofotometer. Zo kan parasietgroei in aanwezigheid van een verscheidenheid aan verbindingen tegelijkertijd worden geëvalueerd en gekwantificeerd in microtiterplaten. Deze methode is toegepast om geneesmiddelen te testen in epimastigote vormen (aanwezig in de insectenvector), trypomastigoten en intracellulaire amastigoten, de zoogdierstadia van de parasiet. Verder zijn verschillende recombinante T. cruzi-stammen getransfecteerd met het pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 plasmide (pLacZ)¹⁰ om de Escherichia coli-β-galactosidase-enzym tot expressie te brengen al beschikbaar (en er kunnen nieuwe worden geconstrueerd), wat de evaluatie mogelijk maakt van parasieten van verschillende discrete typeringseenheden (DTU’s) die zich mogelijk niet gelijk gedragen ten opzichte van dezelfde verbindingen 10,11,12,13 . Deze methode is al met succes gebruikt om verbindingen te evalueren op activiteit tegen T. cruzi in lage en hoge doorvoer screening^12,13. Soortgelijke benaderingen zijn ook gebruikt bij andere protozoaire parasieten, waaronder Toxoplasma gondii en Leishmania mexicana^14,15.

Dit artikel beschrijft en toont een gedetailleerde methode voor een in vitro medicijnscreening tegen alle levenscyclusstadia van T. cruzi met behulp van parasieten die β-galactosidase tot expressie brengen. De hier gepresenteerde testen zijn uitgevoerd met een β-galactosidase-expresserende T. cruzi-lijn verkregen door transfectie van T. cruzi Dm28c stam van DTU I¹³ met pLacZ plasmide (Dm28c/pLacZ). Bovendien kan hetzelfde protocol eenvoudig worden aangepast aan andere stammen om de prestaties tussen verbindingen en tussen T. cruzi-stammen of DTU’s te vergelijken.