Una plataforma flexible para monitorear el aprendizaje asociativo sensorial dependiente del cerebelo
Summary
Hemos desarrollado una plataforma única para rastrear el comportamiento animal durante dos tareas de aprendizaje asociativo dependientes de la fibra de escalada. El diseño de bajo costo permite la integración con experimentos optogenéticos o de imágenes dirigidos a la actividad cerebelosa asociada a la fibra de escalada.
Abstract
La escalada de entradas de fibra a las células de Purkinje proporciona señales instructivas críticas para el aprendizaje asociativo dependiente del cerebelo. El estudio de estas señales en ratones con cabeza fija facilita el uso de métodos de imagen, electrofisiológicos y optogenéticos. Aquí, se desarrolló una plataforma de comportamiento de bajo costo (~ $ 1000) que permite el seguimiento del aprendizaje asociativo en ratones con cabeza fija que se vuelven libremente en una rueda de carrera. La plataforma incorpora dos paradigmas comunes de aprendizaje asociativo: el acondicionamiento del parpadeo ocular y el acondicionamiento de sobresalto táctil retardado. El comportamiento se rastrea utilizando una cámara y el movimiento de la rueda por un detector. Describimos los componentes y la configuración y proporcionamos un protocolo detallado para la capacitación y el análisis de datos. Esta plataforma permite la incorporación de estimulación optogenética e imagen de fluorescencia. El diseño permite que una sola computadora host controle múltiples plataformas para entrenar a múltiples animales simultáneamente.
Introduction
El condicionamiento pavloviano de la asociación subsegundo entre estímulos para provocar una respuesta condicionada se ha utilizado durante mucho tiempo para sondear el aprendizaje dependiente del cerebelo. Por ejemplo, en el acondicionamiento clásico de retardo del parpadeo ocular (DEC), los animales aprenden a hacer un parpadeo protector bien oportuno en respuesta a un estímulo condicional neutro (CS; por ejemplo, un destello de luz o tono auditivo) cuando se combina repetidamente con un estímulo incondicional (US; por ejemplo, una bocanada de aire aplicada a la córnea) que siempre provoca un parpadeo reflejo, y que llega al final o cerca del final del CS. La respuesta aprendida se conoce como respuesta condicionada (RC), mientras que la respuesta refleja se conoce como respuesta incondicionada (UR). En conejos, las lesiones específicas del cerebelo interrumpen esta forma de aprendizaje 1,2,3,4. Además, los picos complejos celulares de Purkinje, impulsados por sus entradas de fibra ascendente5, proporcionan una señal necesaria de 6,7 y 8,9 suficiente para la adquisición de CR correctamente sincronizados.
Más recientemente, se han desarrollado paradigmas de aprendizaje asociativo dependientes de la fibra para ratones con cabeza fija. DEC fue el primer paradigma de aprendizaje asociativo que se adaptó a esta configuración10,11. El DEC en ratones fijos de cabeza se ha utilizado para identificar regiones cerebelosas 11,12,13,14,15,16,17 y elementos de circuito 11,1 2,13,14,15,18,19 que son necesarios para la adquisición y extinción de tareas. Este enfoque también se ha utilizado para demostrar cómo evoluciona la representación fisiológica a nivel celular de los parámetros de la tarea con el aprendizaje 13,15,16.
Además del parpadeo ocular, el paradigma del acondicionamiento táctil de sobresalto retardado (DTSC) se desarrolló recientemente como una novedosa tarea de aprendizaje asociativo para ratones con cabeza fija20. Conceptualmente similar al DEC, DTSC implica la presentación de un CS neutro con un US, un toque en la cara suficiente en intensidad para activar un reflejo de sobresalto21,22 como el UR. En el paradigma DTSC, tanto el UR como el CR se leen como locomoción hacia atrás en una rueda. DTSC ahora se ha utilizado para descubrir cómo el aprendizaje asociativo altera la actividad cerebelosa y los patrones de expresión génica20.
En este trabajo, se desarrolló un método para aplicar de manera flexible DEC o DTSC en una sola plataforma. Los atributos de estímulo y plataforma se esquematizan en la Figura 1. El diseño incorpora la capacidad de rastrear el comportamiento de los animales con una cámara, así como un codificador giratorio para rastrear la locomoción del mouse en una rueda. Todos los aspectos del registro de datos y la estructura de prueba están controlados por microcontroladores emparejados (Arduino) y una computadora de placa única (SBC; Raspberry Pi). Se puede acceder a estos dispositivos a través de una interfaz gráfica de usuario proporcionada. Aquí, presentamos un flujo de trabajo para la configuración, preparación y ejecución de experimentos, y una canalización de análisis personalizada para la visualización de datos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La plataforma con protocolos asociados descritos aquí se puede utilizar para rastrear de manera confiable el comportamiento animal en dos tareas de aprendizaje asociativo sensorial. Cada tarea depende de la comunicación intacta a través de la vía de la fibra de escalada. En el diseño descrito aquí, incorporamos elementos para facilitar el aprendizaje y el registro / perturbación de la respuesta cerebelosa. Estos incluyen una rueda para permitir la locomoción libre11,18<sup class…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo está respaldado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud Mental NRSA F32 MH120887-03 (a G.J.B.) y R01 NS045193 y R01 MH115750 (a S.S-H.W.). Agradecemos a los Dres. Bas Koekkoek y Henk-Jan Boele por las útiles discusiones para optimizar la configuración de DEC y a los Dres. Yue Wang y Xiaoying Chen por las útiles discusiones para optimizar la configuración de DTSC.
Materials
| "B" Quick Base For C&B METABOND – 10 mL bottle | Parkell | S398 | Dental cement solvent |
| "C" Universal TBB Catalyst – 0.7 mL | Parkell | S371 | Catalyst |
| #8 Washers | Thorlabs | W8S038 | Washers |
| 0.250" (1/4") x 8.00" Stainless Steel Precision Shafting | Servocity | 634172 | 1/4" shaft |
| 0.250” (0.770") Clamping Hub | Servocity | 545588 | Clamping hub |
| 1/4" to 6 mm Set Screw Shaft Coupler- 5 pack | Actobotics | 625106 | Shaft-coupling sleeve |
| 1/4"-20 Cap Screws, 3/4" Long | Thorlabs | SH25S075 | 1/4" bolt |
| 100 pcs 5 mm 395–400 nm UV Ultraviolet LED Light Emitting Diode Clear Round Lens 29 mm Long Lead (DC 3V) LEDs Lights +100 pcs Resistors | EDGELEC | ED_YT05_U_100Pcs | CS LEDs |
| 2 m Micro HDMI to DVI-D Cable – M/M – 2 m Micro HDMI to DVI Cable – 19 pin HDMI (D) Male to DVI-D Male – 1920 x 1200 Video | Star-tech | HDDDVIMM2M | Raspberry Pi4B to monitor cable |
| 256 GB Ultra Fit USB 3.1 Flash Drive | SanDisk | SDCZ430-256G-G46 | USB thumb drive |
| 3.3 V–5 V 4 Channels Logic Level Converter Bi-Directional Shifter Module | Amazon | B00ZC6B8VM | Logic level shifter |
| 32 GB 95 MB/s (U1) microSDHC EVO Select Memory Card | Samsung | MB-ME32GA/AM | microSD card |
| 4.50" Aluminum Channel | Servocity | 585444 | 4.5" aluminum channel |
| 48-LED CCTV Ir Infrared Night Vision Illuminator | Towallmark | SODIAL | Infrared light array |
| 4PCS Breadboards Kit Include 2PCS 830 Point 2PCS 400 Point Solderless Breadboards for Proto Shield Distribution Connecting Blocks | REXQualis | B07DL13RZH | Breadboard |
| 5 Port Gigabit Unmanaged Ethernet Network Switch | TP-Link | TL-SG105 | Ethernet switch |
| 5 V 2.5 A Raspberry Pi 3 B+ Power Supply/Adapter | Canakit | DCAR-RSP-2A5 | Power supply for Raspberry Pi 3B+ |
| 5-0 ETHILON BLACK 1 x 18" C-3 | Ethicon | 668G | Sutures |
| 6 mm Shaft Encoder 2000 PPR Pushpull Line Driver Universal Output Line Driver Output 5-26 V dc Supply | Calt | B01EWER68I | Rotary encoder |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 1", 5 Pack | Thorlabs | TR1-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 2", 5 Pack | Thorlabs | TR2-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 4", 5 Pack | Thorlabs | TR4-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 6", 5 Pack | Thorlabs | TR6-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Post Holder, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 2" | Thorlabs | PH2 | Optical post holder |
| Adapter-062-M X LUER LOCK-F | The Lee Co. | TMRA3201950Z | Solenoid valve luer adapter |
| Aeromat Foam Roller Size: 36" Length | Aeromat | B002H3CMUE | Foam roller |
| Aluminum Breadboard 10" x 12" x 1/2", 1/4"-20 Taps | Thorlabs | MB1012 | Aluminum breadboard |
| Amazon Basics HDMI to DVI Adapter Cable, Black, 6 Feet, 1-Pack | Amazon | HL-007347 | Raspberry Pi3B+ to monitor cable |
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | Arduino Uno (microcontroller board) |
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Arduino Due (microcontroller board) |
| Bench Power Supply, Single, Adjustable, 3 Output, 0 V, 24 V, 0 A, 2 A | Tenma | 72-8335A | Power supply |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet, 12" x 24" x 1/8" | McMaster Carr | 8560K257 | Acrylic sheet |
| CNC Stepper Motor Driver 1.0–4.2 A 20–50 V DC 1/128 Micro-Step Resolutions for Nema 17 and 23 Stepper Motor | Stepper Online | B06Y5VPSFN | Stepper motor driver |
| Compact Compressed Air Regulator, Inline Relieving, Brass Housing, 1/4 NPT | McMaster Carr | 6763K13 | Air source regulator |
| Cotton Swab | Puritan | 806-WC | Cotton swab |
| Dell 1908FP 19" Flat Panel Monitor – 1908FPC | Dell | 1908FPC | Computer monitor |
| Flex Cable for Raspberry Pi Camera | Adafruit | 2144 | camera serial interface cable |
| High Torque Nema 17 Bipolar Stepper Motor 92 oz·in/65 N·cm 2.1 A Extruder Motor | Stepper Online | 17HS24-2104S | Stepper motor |
| Isoflurane | Henry Schein | 66794001725 | Isoflurane |
| Krazy Maximum Bond Permanent Glue, 0.18 oz. | Krazy Glue | KG483 | Cyanoacrylate glue |
| Lidocaine HCl | VetOne | 510212 | Lidocaine |
| Low-Strength Steel Hex Nut, Grade 2, Zinc-Plated, 1/4"-20 Thread Size | McMaster Carr | 90473A029 | Nuts |
| M3 x 50 mm Partially Threaded Hex Key Socket Cap Head Screws 10 pcs | Uxcell | A16040100ux1380 | M3 bolt |
| NEMA 17 Stepper Motor Mount | ACTOBOTICS | 555152 | Stepper motor mount |
| Official Raspberry Pi Power Supply 5.1 V 3 A with USB C – 1.5 m long | Adafruit | 4298 | Power supply for Raspberry Pi 4B |
| Optixcare Dog & Cat Eye Lube Lubricating Gel, 0.70-oz tube | Optixcare | 142422 | Opthalimic ointment |
| Precision Stainless Steel Ball Bearing, Shielded, Trade No. R188-2Z, 13000 rpm Maximum Speed | McMaster-Carr | 3759T57 | Bearing |
| Premium Female/Female Jumper Wires – 40 x 6" | Adafruit | 266 | Wires |
| Premium Female/Male 'Extension' Jumper Wires – 40 x 6" (150 mm) | Adafruit | 826 | Wires |
| Premium Male/Male Jumper Wires – 40 x 6" | Adafruit | 758 | Wires |
| Radiopaque L-Powder for C&B METABOND – 5 g | Parkell | S396 | Dental cement powder |
| Raspberry Pi (3B+ or 4B) | Adafruit | 3775 or 4295 | Raspberry Pi |
| Raspberry Pi NoIR Camera Module V2 – 8MP 1080P30 | Raspberry Pi Foundation | RPI3-NOIR-V2 | Raspberry NoIR V2 camera |
| Right-Angle Bracket, 1/4" (M6) Counterbored Slot, 8-32 Taps | Thorlabs | AB90E | Right-angle bracket |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 3/16" Hex | Thorlabs | RA90 | Right-angle optical post clamp |
| Right-Angle End Clamp for Ø1/2" Posts, 1/4"-20 Stud and 3/16" Hex | Thorlabs | RA180 | Right-angle end clamp |
| RJ45 Cat-6 Ethernet Patch Internet Cable | Amazon | CAT6-7FT-5P-BLUE | Ethernet cable |
| Rotating Clamp for Ø1/2" Posts, 360° Continuously Adjustable, 3/16" Hex | Thorlabs | SWC | Rotating optical post clamps |
| Spike & Hold Driver-0.1 TO 5 MS | The Lee Co. | IECX0501350A | Solenoid valve driver |
| Swivel Base Adapter | Thorlabs | UPHA | Post holder adapter |
| USB 2.0 A-Male to Micro B Cable, 6 feet | Amazon | 7T9MV4 | USB2 type A to USB2 micro cable |
| USB 2.0 Printer Cable – A-Male to B-Male, 6 Feet (1.8 m) | Amazon | B072L34SZS | USB2 type B to USB2 type A cable |
| VHS-M/SP-12 V | The Lee Co. | INKX0514900A | Solenoid valve |
| Zinc-Plated Steel 1/4" washer, OD 1.000" | McMaster Carr | 91090A108 | Washers |
Referenzen
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