Isolamento di cellule endoteliali retiniche murine per il sequenziamento di nuova generazione

L’elevata capacità di sequenziamento degli acidi nucleici tramite approcci di sequenziamento di nuova generazione ha notevolmente migliorato la conoscenza dei ricercatori sulla biologia molecolare e cellulare. Queste tecniche avanzate includono il sequenziamento dell’RNA dell’intero trascrittoma, il sequenziamento del DNA di regioni mirate per identificare i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), il sequenziamento del DNA dei fattori di trascrizione legati nel sequenziamento dell’immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) o le regioni aperte della cromatina nel sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi (ATAC) e il sequenziamento dell’RNA a singola cellula¹ . Nella biologia vascolare, questi progressi hanno permesso ai ricercatori di chiarire complicati meccanismi di sviluppo e malattia, insieme a distinguere i modelli di espressione genica lungo un continuum di fenotipi variabili ^2,3. Gli esperimenti futuri possono definire ulteriormente meccanismi complessi combinando il sequenziamento di prossima generazione con modelli valutati di sviluppo vascolare, ma i metodi per la preparazione del campione devono essere compatibili con le tecniche avanzate di sequenziamento.

La qualità, l’accuratezza e la riproducibilità degli approcci di sequenziamento di nuova generazione dipendono dal metodo di preparazione del campione. Quando si isola un sottogruppo di cellule o si generano sospensioni monocellulari dai tessuti, metodi ottimali di digestione e purificazione sono essenziali per massimizzare il numero di cellule, la vitalità e la purezza della popolazione cellulare ^4,5. Ciò richiede un equilibrio nel metodo di digestione: una forte digestione è necessaria per liberare le cellule dal tessuto e ottenere abbastanza cellule per gli approcci a valle, ma la vitalità cellulare sarà influenzata negativamente se la digestione è troppo forte ^6,7. Inoltre, la purezza della popolazione cellulare è necessaria per risultati solidi e un’analisi accurata dei dati, che può essere realizzata tramite FACS. Ciò evidenzia l’importanza di ottimizzare i metodi di isolamento cellulare per applicare il sequenziamento di prossima generazione a modelli consolidati di sviluppo vascolare.

Un modello ben caratterizzato per studiare lo sviluppo vascolare è il modello di sviluppo vascolare retinico murino. La vascolarizzazione retinica murina si sviluppa postnatale in un plesso superficiale bidimensionale, con germinazione angiogenica iniziale dal nervo ottico visibile al giorno postnatale (P)3, fronte angiogenico con cellule a stelo e punta e maturazione iniziale dei vasi visibili a P6 e maturazione del plesso vascolare visibile dopo P9 ^8,9. Durante il rimodellamento del plesso vascolare iniziale, le cellule endoteliali subiscono una specifica verso fenotipi arteriosi, capillari e venosi in diversi vasi per generare una rete circolatoria^10,11. Pertanto, questo metodo consente ai ricercatori di visualizzare la formazione del plesso vascolare angiogenico e la specifica e la maturazione endoteliale arterioso-venosa in vari punti temporali durante lo sviluppo⁹. Inoltre, questo modello fornisce un metodo per studiare gli effetti della manipolazione transgenica sull’angiogenesi e sullo sviluppo del plesso vascolare, che è stato applicato per lo studio dello sviluppo vascolare, delle malformazioni arterio-venose e della neovascolarizzazione indotta dall’ossigeno 12,13,14,15,16 . Al fine di combinare approcci di sequenziamento di nuova generazione con il modello di sviluppo vascolare retinico murino, è necessario un protocollo ottimizzato per l’isolamento delle cellule endoteliali dal tessuto retinico.

Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per digerire il tessuto retinico dai topi a P6 per massimizzare la resa, la purezza e la vitalità delle cellule. Il tessuto retinico viene isolato dai topi P6, digerito per 20 minuti, immunocolorato per CD31 e CD45 e purificato attraverso FACS per isolare una sospensione a singola cellula di cellule endoteliali in circa 2,5 ore (Figura 1A). Si è scoperto che queste cellule endoteliali mantengono un’elevata vitalità per 60 minuti dopo l’isolamento¹⁷, consentendo la preparazione della libreria per i metodi di sequenziamento di prossima generazione. Inoltre, vengono forniti risultati rappresentativi per i risultati del gating FACS e del controllo di qualità da due diversi metodi di sequenziamento di nuova generazione che utilizzano questo protocollo di isolamento: sequenziamento dell’RNA dell’intero trascrittoma e sequenziamento dell’RNA a singola cellula. Questo metodo consente di utilizzare approcci di sequenziamento di nuova generazione in combinazione con il modello di vascolarizzazione retinica per chiarire nuovi meccanismi di sviluppo vascolare.