Выделение эндотелиальных клеток мышиной сетчатки для секвенирования следующего поколения
Summary
Этот протокол описывает метод выделения мышиных постнатальных эндотелиальных клеток сетчатки, оптимизированных для выхода клеток, чистоты и жизнеспособности. Эти клетки подходят для подходов к секвенированию следующего поколения.
Abstract
Недавние улучшения в секвенировании следующего поколения расширили знания исследователей о молекулярной и клеточной биологии, а несколько исследований выявили новые парадигмы в сосудистой биологии. Применение этих методов к моделям развития сосудов требует оптимизации методов выделения клеток из эмбриональных и постнатальных тканей. Выход, жизнеспособность и чистота клеток должны быть максимальными, чтобы получить точные и воспроизводимые результаты от подходов к секвенированию следующего поколения. Модель васкуляризации сетчатки неонатальной мыши используется исследователями для изучения механизмов развития сосудов. Исследователи использовали эту модель для изучения механизмов ангиогенеза и спецификации артериально-венозной судьбы во время формирования и созревания кровеносных сосудов. Применение методов секвенирования следующего поколения для изучения модели развития сосудов сетчатки требует оптимизации метода выделения эндотелиальных клеток сетчатки, который максимизирует выход клеток, жизнеспособность и чистоту. Этот протокол описывает метод выделения, переваривания и очистки мышиной ткани сетчатки с использованием флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS). Результаты показывают, что очищенная FACS популяция CD31+/CD45-эндотелиальных клеток высоко обогащена экспрессией генов эндотелиальных клеток и не демонстрирует изменений жизнеспособности в течение 60 мин после FACS. Включены репрезентативные результаты подходов к секвенированию следующего поколения на эндотелиальных клетках, выделенных с использованием этого метода, включая объемное секвенирование РНК и секвенирование одноклеточной РНК, демонстрируя, что этот метод изоляции эндотелиальных клеток сетчатки совместим с приложениями секвенирования следующего поколения. Этот метод изоляции эндотелиальных клеток сетчатки позволит использовать передовые методы секвенирования для выявления новых механизмов развития сосудов.
Introduction
Высокая пропускная способность секвенирования нуклеиновых кислот с помощью подходов к секвенированию следующего поколения значительно расширила знания исследователей в области молекулярной и клеточной биологии. Эти передовые методы включают секвенирование РНК всего транскриптома, секвенирование ДНК целевых областей для идентификации однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), секвенирование ДНК связанных факторов транскрипции в секвенировании иммунопреципитации хроматина (ChIP) или открытые области хроматина в анализе для секвенирования транспозазно-доступного хроматина (ATAC) и секвенирование одноклеточной РНК1 . В сосудистой биологии эти достижения позволили исследователям прояснить сложные механизмы развития и заболевания, а также различать паттерны экспрессии генов в континууме различных фенотипов 2,3. Будущие эксперименты могут дополнительно определить сложные механизмы, объединив секвенирование следующего поколения с оцененными моделями развития сосудов, но методы подготовки образцов должны быть совместимы с передовыми методами секвенирования.
Качество, точность и воспроизводимость подходов к секвенированию следующего поколения зависят от метода подготовки образцов. При выделении подмножества клеток или генерации одноклеточных суспензий из тканей оптимальные методы пищеварения и очистки необходимы для максимизации количества клеток, жизнеспособности и чистоты клеточной популяции 4,5. Это требует баланса в методе пищеварения: сильное пищеварение необходимо для высвобождения клеток из ткани и получения достаточного количества клеток для последующих подходов, но жизнеспособность клеток будет негативно затронута, если пищеварение слишкомсильное 6,7. Кроме того, чистота клеточной популяции необходима для надежных результатов и точного анализа данных, который может быть выполнен с помощью FACS. Это подчеркивает важность оптимизации методов изоляции клеток для применения секвенирования следующего поколения к установленным моделям развития сосудов.
Хорошо охарактеризованной моделью для исследования развития сосудов является модель развития сосудов сетчатки мышей. Мышная сосудистая сетчатка развивается постнатально в двумерном поверхностном сплетении, с начальным ангиогенным прорастанием из зрительного нерва, видимым на постнатальный день (P)3, ангиогенным фронтом со стеблевыми и кончиковыми клетками и начальным созреванием сосудов, видимым при P6, и созреванием сосудистого сплетения, видимым после P9 8,9. Во время ремоделирования начального сосудистого сплетения эндотелиальные клетки подвергаются спецификации в отношении артериальных, капиллярных и венозных фенотипов в разных сосудах для создания кровеносной сети10,11. Таким образом, этот метод позволяет исследователям визуализировать формирование ангиогенного сосудистого сплетения и эндотелиальную артериально-венозную спецификацию и созревание в различные моменты времени во время развития9. Кроме того, данная модель предоставляет метод исследования влияния трансгенных манипуляций на ангиогенез и развитие сосудистого сплетения, который был применен для исследования развития сосудов, артериально-венозных мальформаций и кислород-индуцированной неоваскуляризации 12,13,14,15,16 . Чтобы объединить подходы секвенирования следующего поколения с моделью развития сосудов сетчатки мышей, необходим оптимизированный протокол выделения эндотелиальных клеток из ткани сетчатки.
Этот протокол описывает оптимизированный метод переваривания ткани сетчатки у мышей при Р6 для максимизации выхода клеток, чистоты и жизнеспособности. Ткань сетчатки выделяют у мышей P6, переваривают в течение 20 мин, иммунораступят для CD31 и CD45 и очищают через FACS для выделения одноклеточной суспензии эндотелиальных клеток примерно через 2,5 ч (рисунок 1A). Было обнаружено, что эти эндотелиальные клетки сохраняют высокую жизнеспособность в течение 60 мин после изоляции17, что позволяет подготовить библиотеку к методам секвенирования следующего поколения. Кроме того, репрезентативные результаты предоставляются для facS-мониторинга и результатов контроля качества двух отдельных методов секвенирования следующего поколения с использованием этого протокола изоляции: секвенирование РНК всего транскриптома и секвенирование одноклеточной РНК. Этот метод позволяет использовать подходы секвенирования следующего поколения в сочетании с моделью васкуляризации сетчатки для выяснения новых механизмов развития сосудов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает метод выделения эндотелиальных клеток из постнатальной мышиной ткани сетчатки, который был оптимизирован для высокого количества клеток, чистоты и жизнеспособности. Чистота клеток достигается путем выделения FACS популяций эндотелиальных клеток из переваренн?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Спасибо Йельскому центру проточной цитометрии, Центру проточной цитометрии Университета Вирджинии, Йельскому центру геномного анализа и Технологическому ядру Университета Вирджинии за их усилия, опыт и советы по участию в представленных экспериментах. Это исследование финансировалось грантами NIH N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) и K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).
Materials
| 2 mL Eppendorf safe-lock tubes | USA Scientific | 4036-3352 | |
| 5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| 60 mm Non TC-treated Culture Dish | Corning | 430589 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control | BD Biosciences | 553932 | |
| BD FACSChorus Software | BD Biosciences | FACSCHORUS | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | FACSMELODY | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | 234115 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3548 | |
| D-Glucose | Gibco | A2494001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 12-711-9AM | |
| Dissecting Pan Wax | Carolina | 629100 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Dissection Stereo Microscope M165 FC | Leica | M165FC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-052 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Eppendorf Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 22364120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fine dissection forceps | Fine Science Tools | 11250-00 | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630130 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | 11695067772 | |
| Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath | Fisher Scientific | FSGPD20 | |
| Primer: ActB_Forward: 5’- agagggaaatcgtgcgtgac -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: ActB_Reverse: 5’- caatagtgatgacctggccgt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Forward: 5’- gagcccaatcacgtttcagttt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Reverse: 5’- tccttcctgcttcttgctagct -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Forward: 5’- gggttgttctgtgccttgtt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Reverse: 5’- ctggacggacacagttagca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Forward: 5’- tcctctgcatcctcactatcaca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5’- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated | ThermoFisher | 75002477 | |
| SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5120 | |
| Trypan Blue Solution | ThermoFisher | 15250061 | |
| V450 Rat Anti-Mouse CD45 | BD Biosciences | 560501 | |
| V450 Rat IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560457 |
Referenzen
- Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. Overview of next-generation sequencing technologies. Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59 (2018).
- Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Single cell analysis in vascular biology. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42 (2020).
- Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).
- Potter, A. S., Potter, S. S., S, Dissociation of tissues for single-cell analysis. Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).
- Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq. Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).
- Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).
- Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D’Amore, P. Characterization of vascular development in the mouse retina. Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).
- Crist, A., Young, C., Meadows, S. Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina. Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).
- dela Paz, N. G., D’Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).
- Fang, J. S., Hirschi, K. K. Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification. F1000Res. 8, (2019).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Ruiz, S., et al. A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10. Scientific Reports. 6, 37366 (2016).
- Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communication. 8 (1), 2149 (2017).
- Ola, R., et al. SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2. Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).
- Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).
- Hulspas, R., O’Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).
- Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
- Green, M. R., Sambrook, J. Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).
- Liu, L., Shi, G. P. CD31: beyond a marker for endothelial cells. Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).
- Zarkada, G., et al. Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation. Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).
- Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells. Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).
- Benedito, R., et al. The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis. Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).
- Daneman, R., et al. Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).
- Okabe, K., et al. Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina. Cell. 159 (3), 584-596 (2014).
- Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).
- Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice. Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514 (2018).
- Ma, W., et al. Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization. eLife. 8, 42049 (2019).
- Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).
- Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation. Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).
- Larrivee, B., et al. ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway. Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).
- Wythe, J. D., et al. ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification. Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).
- Davis, D. M., Purvis, J. E. Computational analysis of signaling patterns in single cells. Seminars in Cell and Developmental Biology. , 35-43 (2015).
- Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
- Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).
- Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).
