Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen aus Mäusen
Summary
Hier stellen wir eine wirtschaftliche und effiziente Methode vor, um hochreine dendritische Knochenmarkzellen aus Mäusen nach 7-tägiger Kultur mit 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 zu isolieren und zu erzeugen.
Abstract
Die Nachfrage nach dendritischen Zellen (DCs) steigt allmählich mit fortschreitender immunbiologischer Forschung. DCs sind jedoch in allen Geweben selten. Die traditionelle Methode zur Isolierung von DCs beinhaltet in erster Linie die Induktion der Knochenmarkdifferenzierung (BM) in DCs durch Injektion großer Dosen (>10 ng / ml) von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor / Interleukin-4 (GM-CSF / IL-4), was das Verfahren komplex und teuer macht. In diesem Protokoll wurden unter Verwendung aller BM-Zellen, die in 10 ng / mL GM-CSF / IL-4-Medium kultiviert wurden, nach 3-4 Halbkulturaustausch bis zu 2,7 x 10 7 CD11c + –Zellen (DCs) pro Maus (zwei Oberschenkelknochen) mit einer Reinheit von 80% -95% geerntet. Nach 10 Tagen in Kultur nahm die Expression von CD11c, CD80 und MHC II zu, während die Anzahl der Zellen abnahm. Die Anzahl der Zellen erreichte nach 7 Tagen Kultur ihren Höhepunkt. Darüber hinaus dauerte diese Methode nur 10 Minuten, um alle Knochenmarkzellen zu ernten, und eine hohe Anzahl von DCs wurde nach 1 Woche Kultur erhalten.
Introduction
Dendritische Zellen (DCs) sind die stärksten Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) zur Aktivierung naiver T-Zellen und zur Induktion spezifischer zytotoxischer T-Lymphozyten-Reaktionen (CTL) gegen Infektionskrankheiten, Allergieerkrankungen und Tumorzellen 1,2,3. DCs sind das primäre Bindeglied zwischen angeborener Immunität und adaptiver Immunität und spielen eine wesentliche Rolle bei der immunologischen Abwehr und der Aufrechterhaltung der Immuntoleranz. In den letzten 40 Jahren haben viele Forscher versucht, die Untergruppen von DCs und ihre Funktionen bei Entzündungen und Immunität zu definieren. Nach diesen Studien entwickeln sich DCs entlang der myeloischen und lymphatischen Linien aus Knochenmarkzellen. Tumorimpfstoffe haben in den letzten Jahren bedeutende Meilensteine erreicht und haben eine vielversprechende Zukunft. Mechanisch modulieren Tumorimpfstoffe die Immunantwort und verhindern das Tumorwachstum, indem sie zytotoxische T-Lymphozyten mit Hilfe von Tumorantigenen aktivieren. Der auf DCs basierende Impfstoff spielt eine wichtige Rolle in der Tumorimmuntherapie und wurde als eine der vielversprechendsten Anti-Tumor-Therapienidentifiziert 1,4. Darüber hinaus wurden DCs häufig bei der Erprobung neuer molekular ausgerichteter Medikamente und Immun-Checkpoint-Inhibitoreneingesetzt 5.
Forscher benötigen dringend eine hohe Anzahl von hochreinen DCs, um die Rolle von DCs weiter zu untersuchen. DCs sind jedoch in verschiedenen Geweben und Blut selten und machen nur 1% der Blutzellen bei Menschen und Tieren aus. Die In-vitro-Kultur von dendritischen Knochenmarkzellen (BMDC) ist eine wichtige Methode, um große Mengen an DC-Zellen zu erhalten. In der Zwischenzeit wurde das Lutz-Protokoll zur Erzeugung von DCs aus Knochenmark von Forschernhäufig verwendet 6. Obwohl das Protokoll bei der Gewinnung von DC-Zellen wirksam ist, ist es komplex und teuer und beinhaltet die Zugabe hoher Konzentrationen von Zytokinen und die Lyse von roten Blutkörperchen.
In dieser Studie berichten wir über eine Methode zur Isolierung fast aller Knochenmarkzellen aus dem Knochenmark (BM) der Maus und zur Induktion der Differenzierung in BMDC nach 7-9 Tagen Inkubation in vitro, mit einer niedrigeren Konzentration von GM-CSF und IL-4. Dieses Verfahren dauert nur 10 Minuten, um fast alle Knochenmarkzellen zu entnehmen und sie in einem vollständigen Medium zu suspendieren. Kurz gesagt, wir bieten eine effiziente und kostengünstige Kultivierungsmethode für BMDC in dieser Forschung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Menschen und Mäuse haben unterschiedliche DC-Untergruppen, einschließlich klassischer DCs (cDCs, einschließlich cDC1s und cDC2s), plasmazytoider DCs (pDCs) und Monozyten-abgeleiteter DCs (MoDCs) 9,10,11. Es ist allgemein anerkannt, dass cDC1s zytotoxische T-Lymphozyten-Reaktionen (CTL) auf intrazelluläre Krankheitserreger und Krebs und cDC2s Immunantworten auf extrazelluläre Krankheitserreger, Parasiten und Allergene reguli…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Programm des Tianjin Science and Technology Plan (20JCQNJC00550), Tianjin Health Science and Technology Project (TJWJ202021QN033 und TJWJ202021QN034) unterstützt.
Materials
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
Referenzen
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