التحكم في الالتصاق الخلية باستخدام تقنيات النقش هيدروجيل للتطبيقات في المجهر قوة الجر
Summary
يتم الجمع بين الطباعة الحجرية القريبة من الأشعة فوق البنفسجية والمجهر قوة الجر لقياس القوى الخلوية على الهيدروجيلات micropatterned. يتيح الإطلاق الموجه للخلايا المفردة الناجم عن الضوء عددا كبيرا من القياسات على نفس العينة.
Abstract
قوة الجر المجهرية (TFM) هو الأسلوب الرئيسي المستخدم في علم الأحياء الميكانيكية لقياس قوات الخلية. عادة ما يتم استخدام هذا للخلايا التي تلتزم الركائز الناعمة المسطحة التي تشوه تحت الجر الخلية (2D-TFM). تعتمد TFM على استخدام المواد المرنة الخطية، مثل البوليديميثيلسيلوكسيان (PDMS) أو البولي أكريلاميد (PA). بالنسبة ل 2D-TFM على السلطة الفلسطينية ، فإن صعوبة تحقيق إنتاجية عالية تنتج بشكل رئيسي عن التباين الكبير في أشكال الخلايا والجر ، مما يدعو إلى التوحيد القياسي. نحن نقدم بروتوكولا لتصنيع بسرعة وكفاءة micropatterned السلطة الفلسطينية الهيدروجيلات لدراسات 2D-TFM. يتم إنشاء المغذيات الدقيقة لأول مرة عن طريق التصوير الضوئي بدون قناع باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية القريبة حيث ترتبط بروتينات المصفوفة خارج الخلية فقط بالمناطق المجهرية ، في حين أن بقية السطح لا يزال غير لاصق للخلايا. يرجع التجزؤ الدقيق لبروتينات المصفوفة خارج الخلية إلى وجود مجموعات ألدهيد نشطة ، مما يؤدي إلى مناطق لاصقة من أشكال مختلفة لاستيعاب الخلايا الفردية أو مجموعات من الخلايا. لقياسات TFM، ونحن نستخدم هيدروجيل السلطة الفلسطينية من مرونة مختلفة عن طريق تغيير كميات من الأكريلاميد وببيس أكريلاميد وتتبع تشريد الخرز الفلورية جزءا لا يتجزأ لإعادة بناء حقول الجر الخلية مع قياس الخلايا تحويل فورييه (FTTC).
لتحقيق مزيد من التسجيل الدقيق لقوات الخلية، ونحن نصف استخدام جرعة تسيطر عليها من الضوء المنقوش لإطلاق الجر الخلية في مناطق محددة لخلايا واحدة أو مجموعات من الخلايا. ونحن ندعو هذه الطريقة المحلية الأشعة فوق البنفسجية قوة الجر المجهر (LUVI-TFM). مع العلاج الأنزيمي ، يتم فصل جميع الخلايا عن العينة في وقت واحد ، في حين أنه مع قوى الجر LUVI-TFM من الخلايا في مناطق مختلفة من العينة يمكن تسجيلها في التسلسل. ونبين قابلية هذا البروتوكول للتطبيق ‘1’ لدراسة قوى الجر الخلوية كدالة للالتصاق الخاضع للرقابة بالركيزة، و’2′ تحقيق عدد أكبر من الملاحظات التجريبية من العينة نفسها.
Introduction
عند التفاعل مع بيئتها خارج الخلية ، تمارس الخلايا الملتصقة قوى يتم التوسط فيها بشكل رئيسي من خلال الالتصاقات البؤرية القائمة على integrin التي تربط المصفوفة خارج الخلية (ECM) بالهيكل الخلوي actin. الالتصاقات البؤرية هي تجميعات متعددة الحماية التي تتركز حول ربط integrins إلى بروتينات ECM مثل فيبروكتين والكولاجين. إن تجميع Integrin ونمو التصاقات البؤرية أمر بالغ الأهمية ليس فقط لإنشاء اتصال مستقر ميكانيكيا ، ولكن أيضا لتوظيف بروتينات التصاق بؤرية أخرى ، بما في ذلك تلك التي تنشط مسار RhoA لتنظيم انقباض الخلوية1. تسمح الانقباضات المعتمدة على RhoA للهيكل الخلوي actin للخلايا بالانتشار والهجرة على ECM الأساسي ، وكذلك الشعور بصلابته2. يعتمد توزيع قوى الجر بقوة على منطقة انتشار الخلايا وشكلها ، وكلاهما يعتمد على خصائص المصفوفة وبالتالي يؤثر على التنظيم الهيكل الخلوي ، مما يشكل في نهاية المطاف حلقة تغذية مرتدة مغلقة بين ميكانيكا المصفوفة والتنظيم الهيكل الخلوي3،4.
تقنيات micropatterning السطح تسمح لمراقبة محددة لشكل الخلية من خلال خلق مناطق بحجم ميكرون تقديم البروتينات اللاصقة ECM; وفقا لحجم هذه المناطق، خلايا مفردة، أو مجموعات من الخلايا التي تلتزم micropattern5. يمكن أن تكون منقوشة البروتينات ECM على الركائز الزجاجية من قبل نهج مختلفة مثل الطباعة microcontact، ونقش الصور أو الليزر النقش6. استخدام الأشعة فوق البنفسجية ضوء (λ = 185 أو 375 نانومتر) جنبا إلى جنب مع استراتيجيات السطح المضادة للضروب يوفر المرونة لتصميم مختلف الأشكال والأحجام وشل حركة أنواع البروتين متعددة مع دقة عالية بالقرب من حواف السطح7،8. المناطق المغلفة بالمواد الكيميائية الطاردة للبروتين مثل جليكول البولي إيثيلين (PEG) محمية إما بقناع ضوئي كروم أو نظام مطبوع رقمي بدون قناع (DMD). تسمح الأنماط الموجودة في الأقنعة بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية للمناطق التي سيتم نقشها بعد ذلك ببروتينات ECM. يتطلب نقش أسطح الهيدروجيل مع بروتينات ECM خطوة نقل لإزالة البروتينات من سطح الزجاج وربطها بالأنماط. بدلا من ذلك ، يمكن تحقيق النقش على المواد الناعمة من خلال طلاء قناع الصورة أولا ببروتين طارد ، يليه حرق المناطق غير المقنعة باستخدام إضاءة الأشعة فوق البنفسجية العميقة. منذ الأشعة فوق البنفسجية العميقة يولد الأوزون ويجعل سطح رد الفعل لربط البروتين، ومغطاة المناطق غير المقنعة مع بروتينات ECM وأخيرا هو بلمرة هلام مباشرة على رأس المناطق غير المقنعة9،10.
يمكن استخدام الهيدروجيلات المنقوشة لأداء TFM ، وهي تقنية تقيس قوى الخلية في واجهة الخلية والمواد11. في 2D-TFM، يستخدم المرء السطح المسطح لفيلم بوليمر سميك، حيث تم تضمين حبات العلامة لتتبع التشوهات12،13،14،15. من أجل استخراج ناقلات الإزاحة ، من الضروري الجمع بين صورتين ، واحدة من الحالة المشوهة وصورة مرجعية واحدة دون تشوهات. ثم يتم تعيين الصورتين على بعضهما البعض مع معالجة الصور. في كثافة علامة عالية، ويتم ذلك عادة مع الجسيمات صورة Velocimetry (PIV)، وهو أسلوب راسخ لإعادة بناء التدفق الهيدروديناميكي. في كثافة علامة منخفضة وفي 3D-TFM، ويتم ذلك عادة مع تتبع الجسيمات Velocimetry (PTV)، والذي يتضمن ميزات محددة من مجموعة البيانات التجريبية. مثال على بديل أرخص حسابيا هو التدفق البصري ، مثل خوارزمية كاناد لوكاس توماسي (KLT)16. في حالة الركائز الهيدروجيل، وعادة ما تكون جزءا لا يتجزأ من الخرز الفلورسنت في كثافة عالية أثناء البلمرة المادية، ويتم تسجيل الصور قبل وبعد إطلاق الخلية عند مفرزة الأنزيمية. يؤدي الانفصال الأنزيمي للخلايا الملتصقة ، على سبيل المثال ، عن طريق المحاولة ، إلى إطلاق الجر الخلوي في وقت واحد من جميع الخلايا على الهيدروجيلات ، مما يجعل من الصعب الحصول على تحليل مفصل من عدد كبير من الخلايا.
هنا نقدم بروتوكولا لإعداد الهيدروجيلات micropatterned للسيطرة على شكل الخلية وتوطين وطريقة لقياس كفاءة قوى الجر في تسلسل باستخدام الأشعة فوق البنفسجية لفصل الخلايا الفردية من الركيزة. لقياسات قوة الجر، نقدم تقنية لإنتاج الهيدروجيلات PA ثنائية الطبقات، حيث يتم تضمين الخرز الفلوري فقط في الطبقة العليا، مما يزيد من كثافتها ويقلل من انتشارها الرأسي. الجمع بين إطلاق الأشعة فوق البنفسجية بوساطة من قوى الجر الخلوية مع micropatterning يجعل من الممكن الحصول على السيطرة المكانية على مفرزة الخلية (على سبيل المثال، من خلايا واحدة دون التأثير على التصاق الخلايا الأخرى في المنطقة ذات الاهتمام)، شريطة أن يكون هناك مسافة كافية بين الخلايا المنقوشة. ثم يتم إعادة بناء الجر الخلوي باستخدام الطريقة الأكثر كفاءة وموثوقية ل2D-TFM، وهي فورييه تحويل الجر قياس الخلايا (FTTC) مع إضفاء الطابع النظامي17،18.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، ونحن نصف إعداد micropatterned PA الهيدروجيلات التي تحتوي على حبات الفلورسنت، والتي تستخدم كعلامات fiducial لدراسات TFM. ويستند نهجنا على ثلاث خطوات: 1) إعداد هيدروجيل السلطة الفلسطينية مزدوجة الطبقات؛ (2) إعداد الهيدروجيلات السلطة الفلسطينية ذات الطبقات المزدوجة؛ (2) إعادة تنظيم الهيئة؛ (3) إعداد الكبسولات الهيدرولوجية ذات الطبقات المزدوجة؛ ( 2) micropatterning من البروتينات ECM ونقلها على سطح الهيدروجيل؛ 3) استخدام منقوشة بالقرب من الأشعة فوق البنفسجية ضوء لتي اف ام. الإعداد التجريبي لتحليل الجر الخلية إلى الركيزة يتطلب استخدام مواد مرنة خطية مع قيم صلابة معروفة لحساب القوى المتعلقة بإزاحة الخرز الفلوري26. السلطة الفلسطينية هيدروجيلس سهلة التحضير، صلابة يمكن ضبطها بسهولة، وأنها تستخدم عادة لاستشعار صلابة و TFM18،28. ومع ذلك ، للحصول على مرات البلمرة القابلة للاستنساخ والبوليمرة المتجانسة للهيدرجيل بأكمله ، ينبغي إيلاء الاهتمام لتخزين الظروف والوقت للكواشف ، على سبيل المثال ، يجب الاحتفاظ APS في مجفف لتجنب فقدان نشاطها ؛ يجب حماية TEMED من الضوء المباشر. استخدام HEA المؤتأكسدة يسمح الربط التساهمي للبروتينات مصفوفة على سطح الهيدروجيل، والتي قد تكون مفيدة لتحقيق تشكيل طبقة بروتين كامل ومستقر. وينبغي إعداد حل HEA المؤتأكسدة طازجة في كل مرة يتم فيها تصنيع الهيدروجيلات السلطة الفلسطينية. يوفر هيدروجيل السلطة الفلسطينية ثنائي الطبقات ثلاث مزايا رئيسية: 1) أنه يوفر طريقة بديلة للحصول على توزيع متجانس للخرزات ال fiducial بالقرب من سطح الهيدروجيل ، دون الحاجة إلى جعل الجل رقيقا للغاية (أي <20 ميكرومتر). السيطرة على سمك الهيدروجيل أمر بالغ الأهمية للحصول على قياسات دقيقة مع TFM. عندما تكون الركيزة المرنة رقيقة جدا ، قد تشعر الخلايا القوية الملتصقة مثل الخلايا الليفية وتستجيب ميكانيكيا للركيزة الزجاجية الصلبة الأساسية29،30. الهيدروجيلات سميكة جعل الحصول على صورة لإعادة بناء القوة أكثر تحديا. وعلاوة على ذلك، فإن العديد من المجاهر ليس لديها مساحة كافية لاستيعابها، بالنظر إلى سمك إضافي من الركيزة الزجاجية المستخدمة لإرفاق الهيدروجيل، ما لم يتم استخدام الشرائح المجهرية فائقة الصغر. 2) في هيدروجيل السلطة الفلسطينية ذات الطبقات المزدوجة، يتم تحقيق التوزيع المتجانس للخرزات fiducial بالقرب من سطح هيدروجيل السلطة الفلسطينية دون استخدام جهاز طرد مركزي، ولكن بدلا من ذلك مع حضانة بسيطة من كميات دقيقة من حلول الهيدروجيل والخرز الفلوري. كثافة حبة عالية هي ذات فائدة كبيرة عند إجراء تحليل PIV لأنه يزيد من دقة قوى الجر ونسبة الإشارة إلى الضوضاء دون الحاجة إلى المجهر confocal. 3) حصر الخرز في طبقة رقيقة قريبة من واجهة الخلية والمواد تمكن التصوير من قوى الجر مع المجاهر epifluorescence فضلا عن المجاهر confocal. عند إعداد الهيدروجيل، يجب على المستخدم التأكد من أنه يلتزم بقوة بالزجاج السفلي قبل الشروع في الخطوات اللاحقة للبروتوكول. نوصي باتباع وقت الحضانة المشار إليه لبوليمرة طبقات الهيدروجيل ، لأنه قد يكون من الصعب إزالة الزجاج فوق السطح دون الإضرار بسطح الهيدروجيل.
التقنيات الأكثر شهرة لقياس الخصائص المرنة هي AFM ، المسافات النانوية ، اختبارات الشد ، وقياس الريوميتري. ومع ذلك ، فإن المسافات النانوية تحفز ضغوطا عالية جدا على المواد التي يمكن أن تؤثر على تحديد الخصائص المرنة. اختبارات الشد وقياس الريوميتري من ناحية أخرى هي تقنيات قياس العيان، في حين تتفاعل الخلايا على مقياس مجهري31،32. يسمح AFM بالقياسات على النطاق الدقيق مع انخفاض السلالات في ظل الظروف الفسيولوجية. يمكن أن تتأثر موثوقية قياسات AFM سلبا إذا كانت التفاصيل التجريبية مفقودة (على سبيل المثال، قوة المسافة البادئة والسرعة) أو تم تسجيل بيانات غير كافية27. يصف Huth وآخرون خوارزمية لاستخراج معامل يونغ من بيانات AFM ، والتي تؤكد الحفاظ على تفاصيل القياس constant27. تقدم هذه الخوارزمية تحديدا دقيقا وموثوقا لمعامل يونغ واستخدمت في تجاربنا. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بقياس العديد من المنحنيات على عينات ملفقة في أيام مختلفة واكتسبنا نتائج مشابهة جدا (تباين متوسط القيم من كاليفورنيا 1-2 كيلو باسكال). وهذا يدل على أن صلابة المواد الهلامية لدينا يمكن التنبؤ بها بشكل موثوق.
في هذا البروتوكول، نستخدم وحدة فوتوباترنينج لإنشاء مناطق مجهرية على الزجاج، والتي يتم نقلها بعد ذلك إلى أسطح الهيدروجيل. ويستند micropatterning هو مبين في هذا البروتوكول على DMD (جهاز المرآة الدقيقة الرقمية) القائم على قناع شبه الأشعة فوق البنفسجية الطباعة الحجرية (λ = 375 نانومتر)7. وDMD يتكون من عدد كبير من الميرات الصغيرة على رقاقة. يتوافق بكسل واحد مع مرآة صغيرة واحدة. يتم إسقاط ملف صورة النمط المنقطة من جهاز كمبيوتر من خلال DMD ويركز على السطح باستخدام عدسة موضوعية. بالنسبة ل micropatterning من البروتينات ، يتم استخدام ضوء الليزر المركز لترابط فرش البوليمر الطاردة بمساعدة فوتونيتياتور. بعد ذلك ، تمتلئ المناطق المعرضة ببروتينات ECM. توفر طريقة الاستئصال بدون قناع هذه مرونة كبيرة في تصميم أنماط جديدة ، لأنها لا تعتمد على استخدام قناع ضوئي. تصميم وتطبيق نمط من السهل جدا لأنه يأخذ سوى عدة دقائق باستخدام مجانية مثل Inkscape. ومع ذلك، فإن عدد الأنماط والعينة المنتجة في فترة قصيرة من الزمن هو عيب رئيسي، حيث لا يمكن استخدام هذه الطريقة إلا لأنماط ركيزة واحدة في كل مرة. تستخدم وحدة التصوير الضوئي مصدر ليزر قريب من الأشعة فوق البنفسجية الصلبة التي تنبعث منها عدة ملليواطات. شعاع الليزر غير المهزوا خطير على العينين والجلد. يمكن أن يكون الضوء المنعكس والمتناثر والإشعاع خطيرا أيضا. يجب أن يكون التعامل معها مصحوبا بتعليمات السلامة من ضباط الليزر. الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول عند استخدام وحدة فوتوباترنينج هو التأكد من أن أثناء micropatterning والاجتثاث الليزر يركز بشكل صحيح على السطح. تعتمد جرعة الإضاءة المتسقة (الكثافة مضروبة في الوقت) من ضوء الأشعة فوق البنفسجية أثناء النقش على كيفية تركيز الليزر على السطح. قد تؤدي كثافة ضعيفة على السطح بسبب ضعف التركيز إلى فشل نقل ECM إلى سطح الهيدروجيل مما يؤدي إلى عدم تعلق الخلايا بالهيدرجيل.
في تجارب TFM ، بعد التصوير الأولي للخلايا الملتصقة والعلامات الودودولوجية ، يتم إطلاق الخلايا من هيدروجيل السلطة الفلسطينية عن طريق علاج التريبسين لتسجيل حالتها المريحة. عيب في تنفيذ هذه الخطوة هو التعامل مع العينة على مرحلة المجهر. دون غرفة التخبط، وفتح غطاء الطبق، وسبيراتينغ المتوسطة، والشطف، والحل الجربسين pipetting تمثل تحديا للمبتدئين والمستخدمين ذوي الخبرة. في الواقع، هذه الإجراءات هي مصدر رئيسي للانجراف في محاور xyz ، مما أدى إلى فقدان الموقف والتركيز. لدينا بروتوكول الإضاءة الأشعة فوق البنفسجية المحلية يجعل TFM تقنية أكثر سهولة للمبتدئين. وتجدر الإشارة إلى أننا استخدمنا وحدة تصويرية خالية من الأقنعة متاحة تجاريا، ولكن من حيث المبدأ يمكن استخدام أي نظام إضاءة للأشعة فوق البنفسجية- A، في نهاية المطاف بالاشتراك مع قناع لحماية مناطق الركائز، حيث لا ينبغي تسجيل قوى الجر الخلوية. إن تعريض الخلايا بجرعة كبيرة من الضوء المرئي منخفض الطول الموجي (على سبيل المثال، الضوء البنفسجي الذي يثير انبعاث DAPI) سيؤدي إلى زيادة الإجهاد التأكسدي، والذي يمكن أن يؤدي إلى السمية الضوئية وموت الخلايا. لذلك ، يمكن تطبيق هذه التقنية حتى في المجهر epifluorescence دون وحدة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. ومع ذلك ، حيث أن الكثافة أضعف بكثير ، سيكون من الأسهل بكثير إنجاز TFM مع العلاج الأنزيمي في هذه الحالة.
مع LUVI-TFM من الممكن استخدام نفس العينة لعدة قياسات بسبب انفصال محلي من خلايا واحدة أو مجموعات صغيرة من الخلايا. ومع ذلك، ينبغي إيلاء الاهتمام لاختيار الخلايا لفصل، لتجنب تسجيل القوات من الخلايا المجاورة. وبالتالي، بالنسبة لقياسات الخلية الواحدة في غياب الترباسات الدقيقة، ينبغي تجنب المناطق المزدحمة؛ بالنسبة للقياسات على الخلايا المصغرة المفردة ، يجب تصميم الأنماط بحيث تكون المسافة بين الهياكل المفردة ضعف قطر المنطقة المنقوشة على الأقل. نوصي أيضا بعدم استخدام خلايا من أنماط متجاورة في التسلسل ، ولكن بدلا من أخذ عينات منها من مناطق بعيدة على الركيزة. يتم إجراء قياسنا بشكل جيد على مجهر epifluorescence مجهز بميزة التحكم في التركيز وعدسة 40 × الهواء NA = 0.9 ، حيث تكون مسافة عمل العدسة طويلة بما فيه الكفاية والحركة السريعة من بئر إلى آخر غير قادرة للغاية. مفرزة الخلايا المستهدفة لتطبيقات TFM فعالة لقياس القوة الخلوية لخلية واحدة أو مجموعة خلايا صغيرة كاملة (على سبيل المثال، يصل قطرها إلى 300 ميكرومتر). باستخدام الإعداد لدينا، لاحظنا التقريب الخلية ومفرزة لعلاج الأشعة فوق البنفسجية من الخلايا المفردة (الشكل 3A)، في حين أن مفرزة نادرا ما حدث لمجموعات الخلايا الصغيرة. وهذا قد يؤدي إلى التقليل من شأن قوى الجر الخلية. بالنسبة لمجموعات الخلايا الكبيرة، يوصى بالانزيم الإنزيمي، حيث يجب على المستخدمين استخدام هدف هواء 20x لتصوير الكتلة بأكملها، وهناك حاجة إلى ميزة التحكم في التركيز البؤري. وبما أن عمق تركيز عدسة الهواء 20x أطول بكثير ، فإن المناولة لن تكون حاسمة مثل هدف التكبير الأعلى. يجب على المستخدم التأكد من أن التركيز يتم ضبطه بشكل صحيح لاجتثاث الخلايا ، لأن جرعة الإضاءة تعتمد على تركيز الليزر على السطح. في حين أننا ندرك القيود المحتملة في استخدام LUVI-TFM في تجمعات الخلايا بسبب التفاعلات الميكانيكية المحتملة مع الخلايا غير المعالجة المجاورة ، يمكن أن يتحول هذا الجانب في الواقع إلى أن يكون مفيدا للدراسات حول آليات قذف الخلايا المستهدفة ، على سبيل المثال ، من الطبقات الأحادية الظهارية.
في الختام، مع نهجنا TFM جنبا إلى جنب مع إطلاق الضوء الناجم عن الخلايا micropatterned، ونحن نقدم بروتوكول قوي وعالي الإنتاجية لقياس قوات الالتصاق الخلية. ويمكن زيادة استغلال براعة هذه الطريقة باستخدام المجهر وإعداد التصوير بهدف تحسين الدقة والحساسية.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر السيدة ريبيكا ألفارادو على الدعم المقدم في إنتاج الفيديو البروتوكولي والسيد ستيفن كاسالي على النقد البناء على المخطوطة. نشكر زملاء قسم الفيزياء الحيوية الخلوية، معهد ماكس بلانك للبحوث الطبية على المناقشات المفيدة. الدعم المالي من ماكس بلانك-جيسلشافت إلى E.A.C.-A. ودويتشه Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1129، projektnummer 240245660، P15 إلى E.A.C.-A. و P4 إلى الولايات المتحدة؛ DFG EXC 2082/1-390761711 إلى الولايات المتحدة) هو أيضا معترف به إلى حد كبير. J.B. يشكر مؤسسة كارل زايس على الدعم المالي. E.A.C.-A., C.S. والولايات المتحدة تعترف التمويل من خلال ماكس بلانك مدرسة المسألة إلى الحياة بدعم من وزارة التعليم والبحوث الاتحادية الألمانية (BMBF). C.S. مدعوم من قبل مجلس البحوث الأوروبي (الموحد منحة PHOTOMECH, no.101001797).
Materials
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | #440159 | Sigma Aldrich | |
| Acetic acid | #33209 | Honeywell | |
| Acrylamide 40 % | #1610140 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
| AFM cantilever | #CP-CONT-BSG-A-G | NanoAndMore | 5 μm spherical tip |
| AFM system | #NanoWizard3 | JPK | Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter |
| Ammonium persulfate | #A3678 | Sigma | |
| Bis-acrylamide 2 % | #1610142 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
| Camera sCMOS | #C11440-42U30 | Hamamatsu | |
| Camera sCMOS | #ANDORZYLA4.2 | Oxford Instrument | |
| CellRox | #C10422 | Thermo Fisher | |
| Custom incubator chamber | EMBLEM | ||
| Dental glue | #1300 100 | Picodent | |
| DMEM | #41965 | Thermo Fisher | |
| Epifluorescence microscope | #Eclipse Ti2E | Nikon | |
| Epifluorescence microscope | #Axiovert200 | Zeiss | |
| Ethanol | #9065.3 | Carl Roth | |
| FBS South America | #S181T | Thermo Fisher | |
| Fibrinogen | #F13191 | Invitrogen | Alexa488 conjugate |
| Fibronectin | #F1141 | Sigma | |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8805 | Invitrogen | Carboxylated (365/415) |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8848 | Invitrogen | Carboxylated (505/515) |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8810 | Invitrogen | Carboxylated (580/605) |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8807 | Invitrogen | Carboxylated (660/680) |
| Glass coverslip 15 mm round | #41001115 | Assistent | |
| Glass coverslip 24 mm round | #41001124 | Assistent | |
| Microscope Objective | #MRH08230 | Nikon | 20x air NA 0.45 |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | #CRL-2991 | ATCC | |
| mPEG-SVA | #MPEG-SVA-5000 | Laysan Bio | |
| N-Hydroxyethyl acrylamide | #697931 | Aldrich | |
| Plasma cleaner | #100-E | TePla | |
| PLPP gel | #PLPPgel | Alveole | |
| Poly-L-lysine | #P4823 | Sigma Aldrich | |
| Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol) | #PLL(20-g[3.5]-PEG(2) | SuSoS | |
| Sodium(meta) periodate | #S1878 | Sigma Aldrich | |
| TEMED | #17919 | Thermo Scientific | |
| UV Pattening module | #PRIMO | Alveole | |
| UVO cleaner | #342-220 | Jelight |
Referenzen
- Geiger, B., Bershadsky, A. Exploring the neighborhood: adhesion-coupled cell mechanosensors. Cell. 110 (2), 139-142 (2002).
- Beningo, K. A., Hamao, K., Dembo, M., Wang, Y. -. l., Hosoya, H. Traction forces of fibroblasts are regulated by the Rho-dependent kinase but not by the myosin light chain kinase. Archives of Biochemistry and Biophysics. 456 (2), 7 (2006).
- Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).
- Kumar, R., Saha, S., Sinha, B. Cell spread area and traction forces determine myosin-II-based cortex thickness regulation. Biochimica Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1866 (12), 118516 (2019).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123, 4201-4213 (2010).
- Strale, P. O., et al. Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. . Microtubules: in vivo Methods in Cell Biology. , 133-146 (2010).
- Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Vignaud, T., Ennomani, H., Thery, M. Polyacrylamide hydrogel micropatterning. Methods Cell Biology. 120, 93-116 (2014).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Polacheck, W. J., Chen, C. S. Measuring cell-generated forces: a guide to the available tools. Nature Methods. 13 (5), 415-423 (2016).
- Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica Biophysica Acta. 1853, 3095-3104 (2015).
- Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying forces in cell biology. Nature Cell Biology. 19 (7), 742-751 (2017).
- Hanke, J., Probst, D., Zemel, A., Schwarz, U. S., Koster, S. Dynamics of force generation by spreading platelets. Soft Matter. 14 (31), 6571-6581 (2018).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).
- Willert, C. E., Gharib, M. Digital particle image velocimetry. Experiments in Fluids. 10, 181-193 (1991).
- Lourenco, L., Krothapalli, A. On the accuracy of velocity and corticity measurements with PIV. Experiments in Fluids. 18, 421-428 (1995).
- Adrian, R. J., Westerweel, J. . Particle Image Velocimetry. , (2011).
- Westerweel, J., Scarano, F. Universal outlier detection for PIV data. Experiments in Fluids. 39 (6), 1096-1100 (2005).
- Dembo, M., Wang, Y. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Schwarz, U. S., et al. Calculation of forces at focal adhesions from elastic substrate data: the effect of localized force and the need for regularization. Biophysical Journal. 83 (3), 1380-1394 (2002).
- Huang, Y., Gompper, G., Sabass, B. A Bayesian traction force microscopy method with automated denoising in a user-friendly software package. Computer Physics Communications. 256, 107313 (2020).
- Vedadghavami, A., et al. Manufacturing of hydrogel biomaterials with controlled mechanical properties for tissue engineering applications. Acta Biomaterialia. 62, 42-63 (2017).
- Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young’s modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
- Oria, R., et al. Force loading explains spatial sensing of ligands by cells. Nature. 552 (7684), 219-224 (2017).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
- Sen, S., Engler, A. J., Discher, D. E. Matrix strains induced by cells: Computing how far cells can feel. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (1), 39-48 (2009).
- Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Letters. 8 (7), 2063-2069 (2008).
- Galluzzi, M., et al. Atomic force microscopy methodology and AFMech Suite software for nanomechanics on heterogeneous soft materials. Nat Communications. 9 (1), 3584 (2018).
