Analisi citometrica a flusso di parametri mitocondriali multipli in cellule staminali pluripotenti indotte umane e loro derivati neurali e gliali
Summary
Questo studio riporta un nuovo approccio per misurare più parametri funzionali mitocondriali basati sulla citometria a flusso e sulla doppia colorazione con due reporter fluorescenti o anticorpi per rilevare cambiamenti nel volume mitocondriale, potenziale di membrana mitocondriale, livello di specie reattive dell’ossigeno, composizione della catena respiratoria mitocondriale e DNA mitocondriale.
Abstract
I mitocondri sono importanti nella fisiopatologia di molte malattie neurodegenerative. I cambiamenti nel volume mitocondriale, il potenziale di membrana mitocondriale (MMP), la produzione mitocondriale di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e il numero di copie del DNA mitocondriale (mtDNA) sono spesso caratteristiche di questi processi. Questo rapporto descrive un nuovo approccio basato sulla citometria a flusso per misurare più parametri mitocondriali in diversi tipi di cellule, tra cui cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) e cellule neurali e gliali derivate da iPSC. Questa strategia basata sul flusso utilizza cellule vive per misurare il volume mitocondriale, i livelli di MMP e ROS, nonché cellule fisse per stimare componenti della catena respiratoria mitocondriale (MRC) e proteine associate al mtDNA come il fattore di trascrizione mitocondriale A (TFAM).
Co-colorando con reporter fluorescenti, tra cui MitoTracker Green (MTG), tetrametilrodamina estere etilico (TMRE) e MitoSox Red, i cambiamenti nel volume mitocondriale, MMP e ROS mitocondriale possono essere quantificati e correlati al contenuto mitocondriale. La doppia colorazione con anticorpi contro le subunità del complesso MRC e la translocasi della membrana mitocondriale esterna 20 (TOMM20) consente la valutazione dell’espressione della subunità MRC. Poiché la quantità di TFAM è proporzionale al numero di copie del mtDNA, la misurazione del TFAM per TOMM20 fornisce una misurazione indiretta del mtDNA per volume mitocondriale. L’intero protocollo può essere eseguito entro 2-3 ore. È importante sottolineare che questi protocolli consentono la misurazione dei parametri mitocondriali, sia a livello totale che a livello specifico per volume mitocondriale, utilizzando la citometria a flusso.
Introduction
I mitocondri sono organelli essenziali presenti in quasi tutte le cellule eucariotiche. I mitocondri sono responsabili dell’approvvigionamento energetico producendo adenosina trifosfato (ATP) attraverso la fosforilazione ossidativa e agiscono come intermediari metabolici per la biosintesi e il metabolismo. I mitocondri sono profondamente coinvolti in molti altri importanti processi cellulari, come la generazione di ROS, la morte cellulare e la regolazione intracellulare di Ca2+. La disfunzione mitocondriale è stata associata a varie malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson (PD), il morbo di Alzheimer (AD), la malattia di Huntington (HD), l’atassia di Friedreich (FRDA) e la sclerosi laterale amiotrofica (SLA)1. Si ritiene inoltre che l’aumento della disfunzione mitocondriale e l’anomalia del mtDNA contribuiscano all’invecchiamento umano 2,3.
Vari tipi di disfunzione mitocondriale si verificano nelle malattie neurodegenerative e cambiamenti nel volume mitocondriale, depolarizzazione MMP, produzione di ROS e alterazioni nel numero di copie del mtDNA sono comuni 4,5,6,7. Pertanto, la capacità di misurare queste e altre funzioni mitocondriali è di grande importanza quando si studiano i meccanismi della malattia e si testano potenziali agenti terapeutici. Inoltre, in considerazione della mancanza di modelli animali che replicano fedelmente le malattie neurodegenerative umane, stabilire adeguati sistemi modello in vitro che ricapitolino la malattia umana nelle cellule cerebrali è un passo importante verso una maggiore comprensione di queste malattie e lo sviluppo di nuove terapie 2,3,8,9.
Le iPSC umane possono essere utilizzate per generare varie cellule cerebrali, comprese le cellule neuronali e non neuronali (cioè le cellule gliali), e il danno mitocondriale associato alla malattia neurodegenerativa è stato trovato in entrambi i tipi di cellule 3,10,11,12,13. I metodi appropriati per la differenziazione delle iPSC in linee neurali e gliali sono disponibili14,15,16. Queste cellule forniscono una piattaforma uomo/paziente unica per la modellazione in vitro della malattia e lo screening dei farmaci. Inoltre, poiché questi sono derivati dai pazienti, i neuroni derivati da iPSC e le cellule gliali forniscono modelli di malattia che riflettono ciò che sta accadendo negli esseri umani in modo più accurato.
Ad oggi, sono disponibili pochi metodi convenienti e affidabili per misurare più parametri funzionali mitocondriali nelle iPSC, in particolare i neuroni viventi e le cellule gliali. L’uso della citometria a flusso fornisce allo scienziato un potente strumento per misurare i parametri biologici, compresa la funzione mitocondriale, in singole cellule. Questo protocollo fornisce dettagli per la generazione di diversi tipi di cellule cerebrali, tra cui cellule staminali neurali (NSC), neuroni e astrociti gliali da iPSC, nonché nuovi approcci basati sulla citometria a flusso per misurare più parametri mitocondriali in diversi tipi di cellule, tra cui iPSC e cellule neurali e gliali derivate da iPSC. Il protocollo fornisce anche una strategia di co-colorazione per l’utilizzo della citometria a flusso per misurare il volume mitocondriale, MMP, livello di ROS mitocondriale, complessi MRC e TFAM. Incorporando misure del volume o della massa mitocondriale, questi protocolli consentono anche la misurazione sia del livello totale che del livello specifico per unità mitocondriale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui sono protocolli per generare neuroni e astrociti derivati da iPSC e valutare molteplici aspetti della funzione mitocondriale utilizzando la citometria a flusso. Questi protocolli consentono un’efficiente conversione delle iPSC umane sia in neuroni che in astrociti gliali e la caratterizzazione dettagliata della funzione mitocondriale, principalmente nelle cellule viventi. I protocolli forniscono anche una strategia basata sulla citometria a flusso di co-colorazione per l’acquisizione e l’analisi di più funzioni mito…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Molecular Imaging Centre e la Flow Cytometry Core Facility dell’Università di Bergen in Norvegia. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Consiglio norvegese per la ricerca (numero di sovvenzione: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat e il China Scholarship Council (numero di progetto: 201906220275).
Materials
| anti-Oct4 | Abcam | ab19857, RRID:AB_445175 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-SSEA4 | Abcam | ab16287, RRID:AB_778073 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-Sox2 | Abcam | ab97959, RRID:AB_2341193 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Pax6 | Abcam | ab5790, RRID:AB_305110 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Nestin | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927, RRID:AB_627994 | Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-GFAP | Abcam | ab4674, RRID:AB_304558 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody. |
| anti-S100β conjugated with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab196442, RRID:AB_2722596 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; |
| anti-TH | Abcam | ab75875, RRID:AB_1310786 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Tuj 1 | Abcam | ab78078, RRID:AB_2256751 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-Synaptophysin | Abcam | ab32127, RRID:AB_2286949 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-PSD-95 | Abcam | ab2723, RRID:AB_303248 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody. |
| anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab198308 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b Alexa Fluor® 488 as an isotype control. |
| anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488 | Santa Cruz Biotechnology | Cat# sc-17764 RRID:AB_628381 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a Alexa Fluor® 488 as an isotype control. |
| anti-NDUFB10 | Abcam | ab196019 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control. |
| anti-SDHA | Abcam | ab137040 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control. |
| anti-COX IV | Abcam | ab14744, RRID:AB_301443 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control. |
| Activin A | PeproTech | 120-14E | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| ABM Basal Medium | Lonza | CC-3187 | Basal medium for astrocyte culture |
| AGM SingleQuots Supplement Pack | Lonza | CC-4123 | Supplement for astrocyte culture |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | CDM ingredient |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Basal medium for dilute Geltrex |
| Bovine Serum Albumin | Europa Bioproducts | EQBAH62-1000 | Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | DA neurons medium ingredient |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer | BD Biosciences, USA | ||
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermo Fisher Scientific | 11905031 | CDM ingredient |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G | Leica Microsystems, Germany | ||
| Corning non-treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430589 | Suspension culture |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Used for a variety of cell culture wash |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565018 | Astrocyte differentiation basal Medium |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| Essential 8 Basal Medium | Thermo Fisher Scientific | A1516901 | Basal medium for iPSC culture |
| Essential 8 Supplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Supplement for iPSC culture |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0314 | Supplement for NSC culture |
| FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Supplement for NSC culture |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12103C | Medium ingredient |
| FGF-basic | PeproTech | 100-18B | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| FCCP | Abcam | ab120081 | Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining |
| Fluid aspiration system BVC control | Vacuubrand, Germany | ||
| Formaldehyde (PFA) 16% | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Cell fixation |
| Geltrex | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | Used for attachment and maintenance of human iPSCs |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Supplement for NSC culture |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | DA neurons medium ingredient |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Used for blocking buffer |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31765027 | Basal medium for CDM |
| Heregulin beta-1 human | Sigma-Aldrich | SRP3055 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H1399 | Stain the nuclei for confocal image |
| Heracell 150i CO2 Incubators | Fisher Scientific, USA | ||
| IMDM | Thermo Fisher Scientific | 21980032 | Basal medium for CDM |
| Insulin | Roche | 1376497 | CDM ingredient |
| InSolution AMPK Inhibitor | Sigma-Aldrich | 171261 | Neural induction medium ingredient |
| Insulin-like Growth Factor-I human | Sigma-Aldrich | I3769 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| KnockOut DMEM/F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Basal medium for NSC culture |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems, Germany | ||
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | CDM ingredient |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | Used for mitochondrial volume indicator |
| MitoSox Red | Thermo Fisher Scientific | M36008 | Used for mitochondrial ROS indicator |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | Neural induction medium ingredient |
| N-2 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Used for blocking buffer |
| Orbital shakers – SSM1 | Stuart Equipment, UK | ||
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7405 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Purmorphamine | STEMCELL Technologies | 72204 | Promotes DA neuron differentiation |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting the coverslip for confocal image |
| PBS 1x | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | Used for a variety of wash |
| Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein | R&D Systems | 423-F8-025/CF | Promotes DA neuron differentiation |
| SB 431542 | Tocris Bioscience | TB1614-GMP | Neural Induction Medium ingredient |
| StemPro Neural Supplement | Thermo Fisher Scientific | A10508-01 | Supplement for NSCs culture |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Cell dissociation reagent |
| Transferrin | Roche | 652202 | CDM ingredient |
| TRITON X-100 | VWR International | 9002-93-1 | Used for cells permeabilization in immunostaining assays |
| TMRE | Abcam | ab113852 | Used for mitochondrial membrane potential staining |
| Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments | Grant Instruments, USA |
Referenzen
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