글리포세이트 기반 제품이 마이크로바이옴에 미치는 잠재적 영향의 정량화

1. GBP의 효과를 테스트하기위한 두 가지 현장 실험 참고: 이 프로토콜은 식물 관련 미생물에 대한 GBP의 효과를 테스트하기 위한 현장 실험 설계의 두 가지 예를 제시합니다. 두 실험 모두 핀란드의 Turku Ruissalo 식물원 대학 (60º26’N, 22º10’E)에서 제초제 또는 농업 용도의 이전 역사가없는 세트 어사이드 필드에서 수행되었습니다. 토양은 유기물의 비율이 높은 모래 점토입니다. 실험 1참고 :이 실험은 잡초와 싸우기 위해 성장기 전후에 GBP 응용 프로그램을 사용하여 노틸 농업의 일반적인 농업 관행을 시뮬레이션하기 위해 고안되었습니다. 실험 필드를 10개의 복제된 대조군과 GBP 처리 플롯(23 m x 1.5 m)으로 나누고, 플롯 사이에 식물의 버퍼 스트립을 사용합니다(2014년 봄 이 연구에서15). 플롯을 회전식 타일러로 5cm 깊이까지 경작하고 일년에 두 번 처리해야합니다. 여기서, 플롯은 성장기의 시작(May)과 끝(October)에서 처리되었다. 대조군 플롯을 수돗물 (5 L / 플롯)으로 처리하고 GBP 플롯을 상업용 GBP (글리포세이트 농도 450 g · L-1, 플롯 당 수돗물 5 L에서 적용 속도 6.4 L·ha-1)은 농업 관행에서 허용되는 최대 글리포세이트 복용량 (3 kg · ha-1)을 모방합니다. 수동 분무기가있는 손으로 작동하는 압력 탱크로 트리트먼트를 적용하십시오. GBP 적용 후 두 주 후, 농업 관행에 따라 귀리 (Avena sativa), 파바 콩 (Vicia faba), 순무 강간 (Brassica rapa subsp. oleifera) 및 식물 감자 (Solanum tuberosum)를 밭에 뿌립니다. 성장기 동안, 식물 경쟁과 토양 구조를 대조군 및 GBP 처리 플롯에서 가능한 한 유사하게 유지하기 위해 플롯을 손으로 잡초를 뽑습니다. 실험 식물에서 미생물을 샘플링하십시오. 이 연구에서, microbiota는 연구 과정에서 성장기에 한 번 GBP 처리 및 대조 처리 플롯 모두에서 2017 년부터 2020 년까지 연속적으로 샘플링되었습니다. 현장에서 식물 샘플 (뿌리 및 잎)의 10 번의 복제물을 수집하여 즉시 얼음 위에 놓고 섹션 2.1에 설명 된대로 추가 처리를 위해 실험실로 가져 오십시오. 실험 2참고 :이 실험은 순환 식품 경제와 관련된 위험을 테스트하기 위해 고안되었습니다. 보다 정확하게는, 작물 식물2 에 비료로서 적용된 분뇨에서의 GBP 잔류물의 결과를 조사하도록 설계되었다(도 3). 12 개월 조류 실험16,17에서 GBP로 오염 된 또는 통제 사료를 먹은 메추라기에서 나무 부스러기, 대변 및 일부 유출 된 사료를 포함한 침구를 수집하십시오.참고 : GBP로 오염 된 사료는 성인 일본 메추라기 16,17에서 킬로그램 체질량 당 12-20mg 글리포세이트의 일일 섭취량에 해당하는160mg 글리포세이트 / kg과 결합 된 닭을 낳기위한 유기농 사료로 구성되었습니다. 검증을 위해, 샘플을 여섯 개의 사료 배치로 글리포세이트 농도 측정을 위해 공인 실험실로 보내라. 또한, 메추라기 배설물 샘플에서 글리포세이트 잔류물을 노출 12개월 후에 측정한다. 대조군은 GBP 첨가 없이 동일한 유기 사료를16,17 첨가하였다. 조류 사육장 실험 중에 격주로 침구를 바꿉니다. GBP 처리 및 제어, 처리 당 수영장에서 8-12 개월 노출에서 정기적으로 사용 된 침구를 수집하고 비료로 사용하기 전에 6 °C의 건조하고 어두운 창고의 밀폐 된 용기에 보관하십시오. 12 L의 침구를 실험 필드의 6 x 6 체스 보드 그리드에서 18 GBP 및 18 개의 제어 플롯 (크기 1 m x 1 m) 각각에 수동으로 두 시점에서 퍼뜨립니다. 이 연구에서 침구는 2018 년 8 월과 2019 년 5 월에 퍼졌습니다. 침구 샘플을 확산 직후 글리포세이트 농도 측정을 위해 공인 실험실로 보내십시오 (이 연구에서 2019 년 5 월). 다년생 풀과 딸기 식물을 각 플롯에 심어 뿌리와 잎 미생물을 연구하십시오.참고 :이 연구에서 네 개의 다년생 잔디 식물 (Festuca pratensis)과 두 개의 딸기 식물 (Fragaria x vescana)을 각 플롯에 심고 뿌리와 잎 미생물을 연구했습니다. 2. 마이크로바이옴 분석 (16S rRNA, ITS 및 EPSPS 유전자) 참고: 대부분의 마이크로바이옴 연구는 차세대 시퀀싱 기술을 사용하여 곰팡이 군집의 박테리아 및 내부 전사 스페이서(ITS) 영역에 대한 16S rRNA 유전자 분석을 기반으로 합니다. 따라서, 논문은 EPSPS의 유형에 대한 정보를 갖지 않는다. 수천 종의 EPSPS 서열은 공용 저장소에서 사용할 수 있습니다 (프로토콜 섹션 3) (그림 4). 16S rRNA 유전자 상기 기술된 실험에서 수집된 분리된 잎 및 뿌리 샘플로부터, 내피 미생물(즉, 식물 조직 내부에 사는 미생물)을 동정한다. 식물 샘플을 수돗물로 씻은 다음 멸균하여 epiphytic 미생물 (즉, 식물 조직 표면의 미생물)을 제거하십시오. 3분 동안 3% 표백제를 사용하여 멸균하고, 이어서 70% 에탄올 용액을 1분 동안 사용하고, 각각 1분 동안 오토클레이브된 초순수로 3회 세척한다. 게놈 DNA 추출이 이루어질 때까지 샘플을 -80°C에서 동결시킨다. 제조업체의 프로토콜에 따라 시판되는 식물 DNA 추출 키트를 사용하여 게놈 DNA 추출을 수행합니다. 박테리아 DNA 18에 특이적으로 결합하는 판별 프라이머를 사용한 중첩된 접근법을 사용하여 추출된 DNA 샘플로부터 16S rRNA 유전자의 가변 영역 V6-V8을 표적화하여, 숙주 식물 DNA로부터의 증폭을 최소화한다. 중합효소 연쇄반응(PCR)의 세 라운드가 끝난 후, 표적 유전자를 바코드 및 어댑터 서열로 태그하여 시퀀싱을 위한 주형으로 제조하였다. PCR 증폭을 위한 단계 2.1.7- 2.1.11을 따르십시오. 각 반응의 총 부피가 30 μL이고 30 ng의 DNA, 1x PCR 버퍼, 0.2 mM dNTPs, 각 프라이머의 0.3 μM 및 2000 U/mL DNA 중합효소로 구성되도록 필요한 샘플 수에 대해 PCR 마스터 믹스를 준비하십시오. PCR의 두 번째 및 세 번째 라운드에 대해 동일한 단계를 수행하십시오. PCR의 첫 번째 라운드의 경우, 프라이머 799F19 및 1492R (20에서 변형)을 사용하십시오 (표 1). 증폭 프로파일을 열순환기 상에 설정한다(95°C에서 3분 초기 변성, 이어서 95°C에서 45초 동안 변성, 54°C에서 45초 동안 어닐링, 72°C에서 1분 동안 연장하는 35 사이클). 최종 연장을 72°C에서 5분 동안 수행한다. PCR의 두 번째 라운드를 위한 주형으로서, 전기영동(1.5% 아가로스 겔 상의 PCR 산물 5 μL)에 의한 증폭을 확인한 다음, 나머지 25 μL의 PCR 산물을 오토클레이브된 초순수에 1:10의 비율로 희석한다. 희석된 PCR 주형 및 프라이머 uni-1062F21 및 uni-1390R22로 PCR을 반복한다(표 1). 사이클 수를 25개로 줄이는 것을 제외하고는 증폭 프로파일과 동일한 PCR 반응 조건(단계 2.1.8)을 유지한다. 생성된 PCR 산물을 오토클레이브된 초순수에 1:1의 비율로 희석한다. PCR의 세 번째 라운드를 수행하여 2.1.8단계에서 언급한 것과 동일한 PCR 프로파일의 8 사이클을 사용하여 바코드 및 P1 어댑터 시퀀스로 제품에 태그를 지정합니다. 도서관 준비 바이오분석기 상에서 PCR 산물의 농도 및 품질을 검증하고, 각 시료의 30 ng의 DNA를 구성하는 부피를 1.5 mL 튜브에 풀링하여 등몰 라이브러리를 제조하였다. 아가로스 겔 카세트 상에서 자동화된 DNA 크기 선택 시스템을 사용하여 크기 분별에 의해 크기 350-550 bp 크기의 앰플리콘을 선택하십시오. 이것은 또한 라이브러리에서 비특이적 앰플리콘 및 PCR 시약을 제거한다는 점에 유의하십시오. 지정된 크기의 앰플리콘으로 구성된 용출액을 카세트에 바이알로 수집하여 정제된 16S rRNA 유전자 라이브러리를 생성한다. 용출액을 1.5 mL 튜브 내로 피펫팅하고 바이오분석기 상의 순도 및 농도를 검증하였다. 오토클레이브된 초순수를 사용하여 DNA 라이브러리를 26 pM의 최종 농도로 희석하고; 샘플이 시퀀싱할 준비가 되었습니다. 그것의참고: ITS 영역은 ITS 특이적 프라이머(표 1)를 사용하여 증폭되며, 생성된 PCR 산물은 시퀀싱을 위한 바코드 및 P1 어댑터 서열로 표지됩니다. ITS 프라이머로 섹션 2.1에서 언급된 것과 동일한 프로토콜에 따라 PCR 마스터 믹스를 제조한다. 열순환기 상의 증폭 프로파일을 95°C에서 5분 초기 변성으로 설정한 다음, 95°C에서 30초 동안 변성, 어닐링 및 연장의 35 사이클, 30초 동안 55°C, 1분 동안 72°C, 및 7분 동안 최종 연장 72°C로 설정한다. PCR 산물 5 μL를 1.5% 아가로스 겔에서 분석하고, 오토클레이브 초순수를 사용하여 나머지 25 μL를 1:10으로 희석하였다. 희석된 PCR 산물을 PCR의 두 번째 라운드를 위한 주형으로 사용한다. 바코드 태그가 지정된 정방향 프라이머 및 P1 어댑터 태그가 지정된 역방향 프라이머를 사용하여 필요한 수의 샘플(단계 2.1.6 참조)에 대해 PCR 마스터 믹스를 준비합니다. 8 사이클을 사용한 것을 제외하고는 단계 2.3.2에서와 동일한 증폭 프로파일로 증폭한다. 섹션 2.2에 언급된 프로토콜에 따라 시퀀싱을 위해 생성된 PCR 산물을 준비합니다. EPSPS 유전자 미생물의 서열을 분석하고 EPSPS 유전자를 분석한다.참고 : GBP 노출이 지역 사회에서 글리포세이트에 민감하고 내성이있는 미생물의 조성을 변화 시켰는지 여부를 발견하기 위해 미생물의 EPSPS 유전자를 시퀀싱하고 분석해야합니다. 따라서, 정렬가능한 타이트 게놈 클러스터(ATGC) 데이터베이스에서 미생물 탁사의 광범위한 컬렉션으로부터 EPSPS 유전자의 353개 서열이 수집되었고, 모든 단백질 서열이22개 정렬되었다. 이들 정렬은 ATGC 데이터베이스(23 )에서 이용가능하며, 보존된 영역으로부터 프라이머를 생성하는데 이용가능하다. 사용하기 쉬운 생물 정보학 도구는 다중 서열 정렬에서 보존 된 영역을 식별하도록 설계되었으며 Pere Puigbo 연구 페이지24에서 사용할 수 있습니다. 그러나 이 웹 서버에 대한 자세한 설명을 제공하는 것은 이 간행물의 범위를 벗어납니다. 그럼에도 불구하고, 글리포세이트에 대한 마이크로바이옴의 민감도를 찾기 위해 EPSPS 유전자의 증폭을 위해 이들 프라이머를 활용하기 위한 장래의 프로토콜이 도 4에 제공된다. 3. 공공 저장소에서 EPSPS 단백질 서열 수집 대진화 연구에 사용되는 EPSPS 서열 PFAM23 (단백질 패밀리 데이터베이스 25), GenBank 24 (유전자, 게놈 및 단백질데이터베이스 26), COG25 (정형 그룹클러스터 27; 고세균 및 박테리아의 정통 단백질 데이터베이스)와 같은 공공 저장소에서 EPSPS 단백질을 수집합니다. 및 PDB26 (단백질 데이터 뱅크28; 단백질 구조의 데이터베이스).참고 : 연구원들이 수행 한 최근 연구에 따르면이 단백질은 시키 메이트 경로12를 갖는 유기체에 대한 글리포세이트의 잠재적 효과에 대한 미세 진화 및 비교 분석을 수행하는 데 활용 될 수 있음을 보여주었습니다. 저자들은 인간 장내 마이크로바이옴(12)으로부터 단백질의 수동으로 큐레이팅된 데이터 세트를 포함하여 수만 개의 EPSPS 단백질 서열(29)에 대한 정보를 수집하는 사용자 친화적인 웹사이트를 개발하였다. 이러한 사전 계산된 데이터 세트의 정보에는 글리포세이트에 대한 민감하고 내성이 있는 추정적인 EPSPS 분류, 종에 대한 분류 정보, EPSPS 활성 사이트의 주석, PDB 및 NCBI 데이터베이스에 대한 링크가 포함됩니다. 또한 웹 서버에는 EPSPS의 ID 코드와 여러 외부 데이터베이스에 대한 링크가 포함되어 있습니다 (표 2). ATGC 미세진화 연구에 사용되는 EPSPS 서열참고: 단백질 서열의 일반적인 저장소는 비교적 먼 유기체들 사이에서 비교 연구를 수행하는데 유용하다; 그러나, 글리포세이트의 잠재적 효과는 진화론적 관점에서 비교적 최근이다. 따라서, 일부 연구에서, 글리포세이트14의 효과를 결정하기 위해 밀접하게 관련된 종(예를 들어, 동일한 박테리아 종으로부터의 상이한 균주)을 비교하는 것이 필요하다. 이러한 경우, 밀접하게 관련된 고세균 및 박테리아 게놈의 포괄적 인 목록을 포함하는 정렬 가능한 타이트 게놈 클러스터 (ATGC) 30의 데이터베이스가 더 적합한 자원입니다. ATGC 데이터베이스는 수백 개의 클러스터(30)로 조직된 수천 개의 게놈으로부터 수백만 개의 단백질에 대한 정보를 포함한다. 각 게놈 클러스터는 정렬 가능하고(게놈은 길이의 ≥85% 이상 동의어를 공유함) 타이트하며(포화 이하의 동의어 치환율을 가짐). 연구자들은 EPSPS 단백질14의 미세 진화 변화를 분석하기 위해 최근 연구에서 ATGC 데이터 세트를 사용했습니다. ATGC에서 EPSPS 단백질 서열을 확인하기 위해서는 다음 단계가 필요합니다. 링크(31 )로부터 ATGC의 전체 데이터베이스와 COG0128의 모든 단백질(데이터베이스의 EPSPS 단백질에 대응하는 코드)32 를 로컬 프로젝트로 다운로드한다.참고: 연구원/실험자가 핀란드에 기반을 둔 경우, CSC-IT 과학 센터33은 스토리지 및 소프트웨어 시설을 제공합니다. 모든 시퀀스를 FASTA 형식으로 수집하는 것이 중요합니다. 대표적인 원핵생물 종 세트에 EPSPS 단백질의 오르토로그를 포함하는 COG0128의 폭발 데이터베이스를 구축했습니다. CSC에는 블라스트 프로그램(34 )이 사전 설치되어 있어, makeblastdb-in COG0128.fa -dbtype prot 명령을 사용하여 EPSPS 시퀀스의 참조 데이터베이스를 생성할 수 있다. blastp -query [ATGC_X.fa] -db [COG0128.fa] -max_target_seqs 1 -outfmt 6 -out tmpfile -evalue 1e-150 명령을 사용하여 반복 블라스트 검색을 사용하여 ATGC 데이터베이스를 COG0128.fa (EPSPS 단백질)에 매핑합니다. 그 결과, 각 내에서 EPSPS 단백질 서열의 데이터 세트를 생성한다. ATGC 데이터베이스로부터 밀접하게 관련된 EPSPS 단백질 서열의 미리 계산된 데이터세트가 이용가능하다(29). 4. 글리포세이트에 대한 유기체의 잠재적 민감도를 결정하는 알고리즘 (EPSPSClass 웹 서버 : 입력, 처리 및 출력) 참고: 연구진은 EPSPS 단백질 서열 12,35의 부류를 결정하기 위해 29에서 자유롭게 사용할 수 있는 사용하기 쉬운 서버를 구현했습니다. 서버는 각 EPSPS 클래스에 대한 동일성 백분율 및 글리포세이트에 대한 그들의 잠재적 민감도를 결정하기 위해 FASTA 포맷의 단백질 서열의 입력만을 필요로 한다. 또한 사용자는 웹 서버를 사용하여 자신의 참조 서열 및 아미노산 마커를 테스트 할 수 있습니다. 먼저, 알고리즘(도 5)은 아미노산 위치를 결정하기 위해 다중 서열 정렬 프로그램(35)을 사용하여 질의 서열 및 참조 서열을 정렬한다. 이어서, 질의 서열의 EPSPS 클래스 (I, II, III, 또는 IV)를 확인하기 위해 아미노산 마커의 존재를 검색한다. 효소의 클래스를 확인하기 위해 입력 텍스트 상자에 FASTA 형식의 EPSPS 단백질 서열을 도입하고(그림 6A), Send를 누릅니다. 제공된 서버에서 glyphosate에 대한 쿼리 시퀀스의 잠재적 민감도를 평가합니다(그림 6B-E).출력 1: 질의 서열 (클래스 I, II, 및 IV)에 존재하는 아미노산 마커 (즉, 동일성) 및 모티프의 수 (클래스 III)의 분획.출력 2: 마커 잔기에 기초한 질의 및 참조 서열의 정렬.출력 3: 쿼리 및 참조 시퀀스의 전체 쌍 정렬.출력 4: EPSPS 참조 서열: 비브리오 콜레라(vcEPSPS, 클래스 I), 콕시엘라 버네티(cbEPSPS, 클래스 II), 브레분디모나스 수포(bvEPSPS, 클래스 III), 스트렙토마이세스 다바웬시스(sdEPSPS, 클래스 IV). 출력 페이지의 끝에서 blastp 및 보존된 도메인과 같은 외부 도구에 대한 링크를 찾아 쿼리 EPSPS 시퀀스를 추가로 분석합니다(그림 6F). 5. 범용 미생물 마커 (16S rRNA 및 ITS )로부터 EPSPS 클래스 평가 참고 : 대부분의 미생물 연구는 16S rRNA 및 / 또는 ITS36의 분석을 기반으로합니다. 이러한 경우, EPSPS 서열의 직접적인 분석을 수행할 수 없다. 따라서, 글리포세이트에 대한 유기체의 잠재적 감수성을 추정하기 위한 확률적 접근법이 필요하다. 이 분석은 간단하며 마이크로바이옴 프로젝트에서 EPSPS 서열의 유형에 대한 합리적인 추정치를 제공합니다. 이 프로세스는 3단계로 나뉩니다(그림 7 및 그림 8). 공용 저장소에서 EPSPS 시퀀스를 식별합니다. 대표 서열의 포괄적인 데이터 세트의 EPSPS 클래스는 PFAM 37, GenBank38, COG39, PDB 40, ATGC 30으로부터 컴파일되고 사전 계산되었다. 분류 정보와 50,000개 이상의 시퀀스의 EPSPS 클래스가 포함된 EPSPSClass 서버의 기본 페이지에서 이러한 데이터 세트에 액세스합니다(그림 7). 성장기 동안 격주로 실험 식물의 높이를 측정하고, 필드 시즌의 끝에서 식물의 지상 바이오매스를 칭량하여 GBP에서의 식물의 생장을 비교하고 대조군 플롯을 비교한다.참고 : 현장 실험의 미생물 분석은 아직 완전히 분석되지 않았습니다. 스프레드시트를 사용하여 마이크로바이옴 실험의 박테리아 OTU(16S rRNA 또는 ITS 기반)를 미리 계산된 데이터 세트로 매핑합니다.참고: 이전의 연구들은 EPSPS 부류(즉, 글리포세이트에 대한 내재적 감수성)가 계통발생 그룹(14) 내에서 고도로 보존된다는 것을 보여주었다. 따라서, 고도로 보존된 분류로부터 밀접하게 관련된 종들이 글리포세이트에 대해 유사한 EPSPS 반응을 가질 수 있다고 가정하는 것이 비교적 안전하다(도 8). 동일한 스프레드시트에서, 확률적 점수(S = s/(s+r+u)에 기초하여, 글리포세이트에 대한 내재적 민감도를 계산하고, 여기서 S: 민감도 점수; s: 잠재적으로 민감한 서열의 수; r: 잠재적으로 내성인 서열의 수; u: 분류되지 않은 서열의 수)는 공개 데이터베이스에서 공지된 EPSPS 서열로부터 계산된다.참고: 이 점수의 범위는 0(탁손에서 민감한 EPSPS 서열이 발견되지 않음)에서 1(탁손의 모든 서열은 글리포세이트에 민감함)(그림 8)까지입니다. 더욱이, 값 사이에 – 즉, 민감성, 내성 또는 알려지지 않은 균주를 가진 종들이 있습니다.