Intracerebral transplantasjon og In Vivo Bioluminescence Sporing av humane nevrale stamceller i musehjernen

MERK: Alle eksperimenter med mus ble utført i samsvar med regjeringens, institusjonelle og ARRIVE-retningslinjer og ble godkjent av Kantonal Veterinary Office of Zurich. Voksne mannlige og kvinnelige ikke-overvektige diabetiker SCID gamma (NSG) mus (10-14 uker, 25-35 g) ble brukt. Mus ble plassert i vanlige Type II/III-bur i grupper på minst to dyr per bur i et fuktighets- og temperaturkontrollert rom med en konstant 12/12 timers lys/ mørk syklus. .). 1. Cellekultur og viral transduksjon Differensier nevrale stamceller (NPCer) fra iPSCer ved hjelp av små molekylhemmere som tidligere beskrevet14. Kultur NPCer15 fra passering 2 og utover i Neural Stamcelle Vedlikehold Medium (NSMM; Tabell 1) supplert med små molekyler (tabell 1) i 6-brønnsplater (2 ml medium per brønn) belagt med poly-ornitin/laminin521 (pLO/L521). Endre mediet daglig.MERK: For å passere NPCer, tilsett 1 ml celledissosiasjonsreagens per brønn (se materialtabellen) og inkuber ved 37 °C i 1 min til de fleste celler løsner. For belegg, inkuber 150 μL pLO i 1 ml 0,1 M fosfatbufret saltvann (PBS) per brønn i 2 timer ved romtemperatur (RT). Etter tre vasker med PBS, inkuber 10 μg L521 i 1 ml PBS per brønn i 2 timer ved RT. For viral transduksjon, plate 50.000 celler per brønn i en 24-brønns plate belagt med pLO / L521 og legg til forhåndspakkede virale vektorer (pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro, LL410PA-1) til hver brønn.MERK: Totalt antall smittsomme enheter (IFU) som tilbys er >2 × 106 IFU og er nok til å infisere 100.000 celler med en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 20. Celletelling er utført med en automatisert celleteller. Transduksjonseffektiviteten avhenger sterkt av den brukte cellelinjen. Arbeid med lentivirus krever overholdelse av lokale retningslinjer for biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2) produkter. Inkuber cellene ved 37 °C i 72 timer, samtidig som du fortsetter daglige middels endringer. Bekreft vellykket transduksjon ved å sjekke cellene for GFP-uttrykk i et fluorescensmikroskop. Sett mikroskopforstørrelsen til 10x eller 20x og bruk riktig eksitasjon (460-480 nm) og utslippsområde (490-520 nm) for å oppdage transinduserte GFP-uttrykkende celler. Kvantifisere forholdet mellom GFP-transdusert og totalceller for å estimere generell transduksjonseffekt.MERK: Transduksjonshastigheter på 65-95% ble oppnådd med denne protokollen. En transduksjonseffekt på >50% anbefales som et go/no-go-kriterium før transplantasjon. Hvis 50% transduksjonseffekt ikke kan oppnås, utfør puromycinvalg eller sorter cellene ved hjelp av strømningscytometri for å øke utbyttet av transinduserte celler. Valgfritt: Frysing av celler Snurr cellene ned (300 × g, 5 min) og kast supernatanten. Resuspend pellet i 1 ml frysemedium (se materialtabellen) og overfør suspensjonen til hetteglass for å få 106 celler/hetteglass. Overfør cellene til frysebokser i 24 timer ved -80 °C og deretter til -150 °C for langtidslagring. 2. Celleforberedelse for transplantasjon Samle et hetteglass med celler fra -150 °C lagring og overfør det til laboratoriet. Tell cellene ved hjelp av en automatisert celleteller.MERK: Hetteglasset inneholder 1,5-2 × 106 celler. Overfør hetteglasset raskt til et 37 °C vannbad til det ikke er igjen iskrystaller (2-3 min).MERK: Det er viktig å tine raskt for å minimere skade på cellemembraner. Ikke senk hetteglasset helt ned i vannbadet, da det kan øke risikoen for forurensning. Overfør hetteglasset til biosikkerhetsskapet og pipette hele innholdet (~1 ml) til et sterilt konisk rør på 15 ml.MERK: Arbeid med lentiviralt transinduserte celler krever BSL-2. Imidlertid fjerner vask og passering av celler virale partikler fra mediet. Informasjon om når overføring fra BSL-2 til BSL-1 er tillatt, bør innhentes fra lokale myndigheter. Tilsett 9 ml steril 1x PBS og sentrifuge i 5 min ved 300 × g, RT. Fjern supernatanten ved aspirasjon ved hjelp av en pipette (1-10 ml); Vipp forsiktig fjæringen mot pipettespissen og begynn å aspirere. Vær forsiktig så du ikke forstyrrer pelletsen. Vask cellene ved å resuspendere i 10 ml steril 1x PBS.MERK: Ta forsiktig av røret for å bruke cellene på nytt i restvolumet. Trianturer celleopphenget langsomt ved hjelp av en 1 ml pipette til den ikke inneholder klumper eller aggregater. Tell cellene før det siste spinnet ved hjelp av en automatisert celleteller. Sentrifuge i 5 min ved 300 × g, RT. Fjern supernatanten (trinn 2.5) og resuspender cellepelleten i det nødvendige volumet av steril PBS til en konsentrasjon på 8 × 104 celler / μL. Plasser cellene på is og bruk dem til transplantasjon innen neste 5 timer.MERK: Et volum på 1,6 × 105 celler/2 μL PBS ble brukt i denne protokollen. 3. Transplantasjonsprosedyre Forberedelse til kirurgi Rengjør og steriliser operasjonsutstyret. Klargjør den stereotaktiske enheten og mikroinjeksjonspumpesystemet.MERK: Det er viktig å teste Hamilton-sprøyten og nålen på 30 G, 2 tommer før du starter. Sett nålen inn i et rør som inneholder steril 0,9% NaCl og tegn løsningen sakte inn og ut. Sett opp anestesimaskinen. Test maskinen før du involverer dyr. Rengjør induksjonskammeret med 70% etanol. Forberedelse av dyr Hold musene i minst 7 dager før forsøkene under standardforhold for å akklimatisere dem.MERK: Følgende dyr ble brukt til denne protokollen: kvinnelig NOD/SCID/IL2rγnull (30-35 g, også kjent som NSG) og hunn C57BL/6J (20-25 g, også kjent som B6). Prosedyren kan også utføres med mannlige mus. Mål musen kroppsvekt og justere dosen av smertestillende som skal injiseres. Administrer carprofen (5 mg/kg kroppsvekt) intraperitonealt for å redusere smerte og/eller forhindre en inflammatorisk respons. Bedøv dyrene ved hjelp av isofluran (3% i induksjonsfasen og 1,5-2% i vedlikeholdsfasen under operasjonen) fordampet i oksygen.MERK: Gassformige anestesi foretrekkes på grunn av en rask vekking etter den kirurgiske prosedyren, og fordi nivåene av bedøvelsesgass lett kan justeres. Bruk nociceptive reflekser for å sikre at dyret er dypt bedøvet (f.eks. tåklemmer). Når dypbedøvelse nås, transporterer du dyret fra induksjonskammeret til den stereotaxiske rammen. Oppretthold anestesi ved hjelp av en ansiktsmaske.MERK: Pustehastigheten må overvåkes visuelt gjennom hele prosedyren (40-60 pust per minutt). Bruk en varmepute for å unngå hypotermi under prosedyren. Påfør oftalmisk smøremiddel for å forhindre at øynene tørker ut. Barber musebunnen med en elektrisk barberhøvel og desinfiser huden med 5% betadinoppløsning ved hjelp av bomullspinne. Fest musehodet og sett ørestengene inn i den eksterne meatusen.MERK: Vær forsiktig så du ikke skader trommehinnene. Påfør lidokainsalve på begge ørekanalene før du setter inn ørestengene. For å sjekke om dyrets hode er i en stabil posisjon, trykk forsiktig ned på hodet for å se om det er bevegelse. Hvis bevegelse er notert, er enten ørestangen, nesestykkets plassering eller begge feil og må justeres på nytt. Kraniotomi Bruk et kirurgisk blad for å lage et kutt langs midtlinjen stor nok til å avsløre lambda og bregma landemerker.MERK: Hudretraktorer kan påføres for å holde skallen eksponert. Trekk tilbake periosteum og fascia med en skalpell og bruk sterile bomullspinne for å tørke skalleoverflaten. Juster øre- og munnstengene for å standardisere hodeposisjonen.MERK: De vertikale koordinatene for bregma og lambda må være identiske for anteroposterior posisjonering. Plasser nålen ved bregmaen og beregn koordinatene til de ønskede injeksjonspunktene (interessekoordinatene som er valgt for denne protokollen: fremre bakre (AP): + 0,5 mm, medial-lateral (ML): + 1,5 mm). Flytt nålen til det punktet og merk den med blekk.MERK: Koordinatene ble valgt basert på Franklin og Paxinos Mouse Brain Atlas 16. Avstandene er mm fra bregmaen. Påfør steril 0,9% NaCl på skallen og bor et hull med en diameter på 2-3 mm gjennom skallen med en kirurgisk tannbor. Flytt nålen til overflaten av duraen og beregn dybdekoordinatene. Transplantasjonsprosedyre Resuspend cellene i røret (trinn 2.9) og trekk 2 μL celle suspensjon i en sprøyte (5 μL eller 10 μL).MERK: Pass på at det ikke finnes luftbobler i celleopphenget. Sprøyten må holdes i horisontal stilling til den monteres i den stereotaktiske enheten for å unngå cellesedimentering. Plasser sprøyten over målstedet (beregnede koordinater: AP: + 0,5 mm, ML: + 1,5 mm) og flytt nålen sakte til overflaten av duraen.MERK: Hvis du er usikker på de riktige koordinatene, utfør injeksjoner med fargestoff og histologisk evaluering av injeksjonsstedet før du transplanterer celler (for mer informasjon, se 17). Før nålen med en hastighet på 0,02 mm/s inn i hjernen opp til riktig dybde (koordinaten som er valgt for denne protokollen er dorsal-ventral (DV) – 0,8 mm). Overskyt dybden med 0,1 mm og trekk nålen over samme avstand for å lage en lomme for de injiserte cellene. Påfør vevslim rundt nålen ved hjelp av tang for å forhindre lekkasje av celler. Injiser 2 μL av den tilberedte celleopphenget med en konstant hastighet på 3-5 nL/s.MERK: Injeksjonsprosedyren varer mellom 7 og 12 min. Etter injeksjon, la nålen være på plass i minst 5 minutter før du sakte trekker den ut. Påfør vevslim for å forsegle hullet i skallen og vent i ytterligere 2 min. Suturer og ettervern Påfør steril 0,9% NaCl-oppløsning på den eksponerte skallen for å unngå dehydrering. Lukk såret med en 5/0 silke sutur tråd. Hydrater dyret med 0,5 ml ringelaktatoppløsning subkutant injisert i korsryggen. Avbryt anestesileveringen og fjern musen forsiktig fra stereotaxic-apparatet og legg den tilbake i et bur som holdes på en varmepute. Overvåk dyrene i den akutte fasen av bardjuryen. Sjekk suturen, dyrevekten og den generelle helsen minst to ganger om dagen. 4. In vivo-avbildning Forberedelse av luciferin Tine D-luciferin kaliumsalt ved RT og lag en fersk lagerløsning av D-luciferin ved 30 mg / ml i PBS. Steriliser lagerløsningen gjennom et 0,22 μm sprøytefilter.MERK: Umiddelbar bruk av arbeidsløsningen anbefales. Om nødvendig kan oppløst luciferin lagres ved -20 °C. Langvarig lagring kan imidlertid føre til nedbrytning av signalet. Luciferin er et lysfølsomt reagens; holde den ute av direkte lys når det er mulig. Alternative substrater kan også vurderes, for eksempel syklisk, for å forbedre løsningsgrensen18. Imaging Første oppsettMERK: Bioluminescensavbildning ble utført ved hjelp av et in vivo-bildesystem (se materialtabellen) som består av et mørkt kammer og et avkjølt lade koblet enhetskamera (CCD). Dobbeltklikk ikonet for Living Image-programvaren , og velg en bruker-ID fra rullegardinlisten. Klikk på Initialiser i kontrollpanelet som vises. Når initialiseringsprosessen er fullført, blir temperaturboksen i kontrollpanelet grønn. Merk av for Lystetthet og Fotografi i kontrollpanelet, og velg Automatisk eksponering (~60 s). Velg et synsfelt (D/12,5 cm ble valgt for denne protokollen). Angi motivhøyden (1,5 cm) og velg alternativet bruk motivhøydefokus. Angi følgende parametere manuelt: stor binning, f/2, blokkert eksitasjonsfilter og åpent utslippsfilter. Bestem injeksjonsmengden av D-luciferin ved 300 mg/kg kroppsvekt. MERK: Standard anbefalt dose er 150 mg/kg D-luciferin. Denne prosedyren ble justert i henhold til en protokoll som rapporterte høyere følsomhet ved bruk av 300 mg/kg18. Injiser luciferin intraperitoneally (dvs.MERK: Hvis dyret må bedøves før injeksjon, må du være oppmerksom på at det kan forlenge topp luciferase uttrykkstiden. Vent i 5 min, og bedøv dyr med kontinuerlig tilførsel av isofluran (4,5% i induksjonsfasen og 1,5-2% i vedlikeholdsfasen under avbildningsprosedyren). Påfør oftalmisk smøremiddel på øynene, og barber deretter de bedøvede dyrene på hodeområdet ved hjelp av en konvensjonell hår barbermaskin. Plasser dyrene i bildekammeret og begynn å avbilde 15 min etter luciferinin-injeksjonen ved å klikke på Skaff deg i kontrollpanelet . 5. Perfusjon Bedøv dyrene ved en i.p. injeksjon av natrium pentobarbital (150 mg / kg kroppsvekt). Vent til musen ikke lenger reagerer på smertefulle stimuli, for eksempel tåklemmer. Legg musen på ryggen og bruk pinsett og saks for å åpne brysthulen. Bruk standard saks for å åpne membranen. Utsett hjertet og sett inn en nål (fra slangen med ringer / 4% paraformaldehydoppløsning (PFA)) i toppen av venstre ventrikel.MERK: Pass på at nålens spiss holdes i lumen på ventrikelen. Klipp høyre ventrikel ved hjelp av saks. Perfuse med ringemiddelløsning (kan holdes på RT) i 3-4 min (strømningshastighet: 17 ml / min). Fortsett til hjertet er rent. Bytt stoppekranen for å tillate strømmen av PFA (oppbevares ved 4 °C, holdes på is under prosedyren) og perfuse i ytterligere 5 minutter (~100 ml). Stopp pumpen og fjern nålen fra venstre ventrikel.MERK: Perfusjonen med PFA bevarer vevsintegriteten jevnt. Det letter også bevaring av GFP-signal i transplantasjonene som ellers kan gå tapt på grunn av diffusjon. 6. Behandling Vevsinnsamling Fjern hodet ved hjelp av standard saks og lag et midtlinje snitt i huden. Snu huden over øynene for å eksponere skallen. Start fra kaudaldelen på punktet av parietalbenet og lag et lite snitt ved hjelp av vårsaks. Før saksen rostrally langs midsagittal sutur opp til et punkt mellom øynene. Start på nytt fra kaudaldelen og gjør to kutt parallelle og ~ 4 mm fra hverandre i sagittalplanet.MERK: Vær forsiktig så du ikke skader hjernen ved å trykke saksen mot den indre overflaten av skallen. Bruk tang til å forsiktig vippe den ene siden av parietalbenet og bryte det av. Gjør det samme med den andre siden.MERK: Bruk en mikrospatula for å frigjøre beinet fra meningene; Ellers kan de skade hjernen mens de bryter av skallen. Hvis deler av frontbenet forblir, gjør et lite kutt for å vippe og bryte av benplaten. For å frigjøre hjernen, skyv mikrospatulaen forsiktig under hjernen (olfaktoriske pærer) og vipp den forsiktig oppover. Etter oppsamling, hold hjernen i 4% PFA-oppløsning i 4-6 timer ved 4 °C. Overfør den til steril 1x PBS etterpå. Immunhiistokjemi Overfør hjernen til en 30% sukroseløsning i minst 48 timer ved 4 °C for å forhindre dannelse av krystaller under frysing. Bruk en glidende mikrotom til å kutte koronal seksjoner med en tykkelse på 40 μm. Samle og oppbevar seksjonene som frittflytende seksjoner (i en 24-brønnsplate) i en kryotopektantløsning (tabell 1) ved -20 °C inntil videre behandling. Skyll seksjonene med 450 μL 1x PBS for hver brønn (3 ganger, 5 min hver, RT). Blokker ikke-spesifikke steder med 450 μL blokkeringsløsning for hver brønn (tabell 1) i 1 time ved RT. Inkuber hver brønn med 450 μL primærantistoffer ved 4 °C over natten. Fortynn antistoffene 1:200 i 3% eselserum; 0,1 % Triton-X-100 i PBS. For å identifisere donormateriale i vertsmiljøet, bruk et antistoff mot menneskespesifikke kjerner (Anti-Human Nuclei Antibody, klone 235-1). Vask seksjonene med 450 μL 1x PBS for hver brønn (3 ganger, 5 min hver, RT). Inkuber hver brønn med 450 μL tilsvarende fluorescerende sekundære antistoffer i 2-3 timer (RT). Fortynn antistoffene i 3% eselserum; 0,1 % Triton-X-100 i 1x PBS. Vask seksjonene med 450 μL 1x PBS for hver brønn (3 ganger, 5 min hver, RT). Flekk kjernene med 450 μL 0,1 μg/ml 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI).