백신 개발을 위한 Chlamydia muridarum 의 재조합 주요 외막 단백질에 무세포 규모 생산 및 보조제 추가

모든 동물 연구는 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 정한 지침에 따라 캘리포니아 대학교 어바인(University of California, Irvine)의 공중 보건 서비스(PHS) 보증 시설에서 수행되었습니다. 1. 유리 제품 준비 참고: 동물용 백신 등급 제제 생산에 사용되는 모든 재료는 내독소가 없습니다. 오염된 내독소를 파괴하려면 완충액을 180°C의 오븐에서 4시간 동안 보관할 수 있는 세척된 유리 제품을 굽습니다. 2. 버퍼 준비 표 1에 열거된 Ni 친화성 정제 완충액 250mL를 준비한다. 4°C에서 최대 6개월 동안 보관하세요. 3. 반응 준비 20mg의 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DMPC)을 내독소가 없는 1.5mL 원심분리기 튜브에 계량합니다. 내 독소가없는 물 1mL에 녹이고, 6 A에서 1 분 동안 최소 4 회 프로브 초음파 처리하고, 그 사이에 1 분 동안 일시 중지하여 투명해질 때까지 초음파 처리합니다. 22°C에서 2분 동안 13,000× g 에서 원심분리하여 프로브에서 오염 금속을 제거한 다음 가용화된 지질을 새로운 1.5mL 내독소가 없는 튜브로 옮깁니다. PEG5k-CA8 텔로덴드리머 1mg을 1.5mL 내독소가 없는 튜브에 계량합니다. 내독소가 없는 물에 20mg/mL 농도로 녹입니다. 완전히 용해될 때까지 소용돌이치고 2mg/mL로 희석합니다. 새로운 내독소가 없는 튜브에서 20mg/mL DMPC 용액 210μL와 2mg/mL 텔로덴드리머 용액 210μL를 결합합니다. 4. 서브유닛 백신 제형을 위한 MOMP-tNLP의 무세포 생산 이전에 발표된 프로토콜5에서 수정된 cell-free 방법을 사용하여 MOMP-tNLP를 준비합니다.cell-free 반응을 설정하기 2시간 전에 원핵생물 cell-free 단백질 발현 키트를 열고 재구성 완충액 중 하나를 해동합니다. 일단 해동되면, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일의 1 정을 추가하고 완전히 녹이되게하십시오. 5 x 1 mL 반응을 실행하도록 설계된 키트를 사용하여 이 프로토콜을 따르십시오.참고: 일반적인 스케일 업 생산은 3 x 1mL입니다.각 1mL 반응에 대해 525μL의 재구성 완충액을 대장균 용해물 병에 넣고 부드럽게 굴려 용해시킵니다. 반응 첨가제(예: ATP, GTP)가 들어 있는 병에 재구성 완충액 250μL를 넣고 부드럽게 롤링하여 용해시킵니다. 8.1mL의 재구성 완충액을 반응 공급 병에 넣고 고무 마개로 다시 덮고(고무 마개 내부를 만지지 않도록 주의) 부드럽게 뒤집거나 굴려 용해시킵니다. 재구성 완충액 3mL를 아미노산 혼합물 병에 넣고 고무 마개로 뚜껑을 덮고 부드럽게 뒤집거나 굴려 녹입니다.알림: 고무 마개 내부를 만지면 오염될 수 있으므로 주의하십시오. 재구성 완충액의 1.8 mL를 메티오닌 병에 추가하고, 녹이기 위하여 살찐 후에 구르고, 그 후에 사용할 때까지 얼음에 저장하십시오. 반응 용액을 준비한다.대장균 용해물 병에 225 μL의 재구성 반응 혼합물, 270 μL의 메티오닌 없이 재구성 아미노산 혼합물, 30 μL의 재구성된 메티오닌을 추가합니다. 또한 DMPC/텔로덴드리머 혼합물 400μL, MOMP 플라스미드 15μg 및 Δ49ApoA1 플라스미드 0.6μg을 추가합니다. 롤/부드럽게 흔들어 섞습니다.참고: 두 플라스미드가 동일한 플라스미드 백본에서 구성되었는지 확인합니다. 소용돌이치지 마십시오. 총 용액 20μL를 취하여 GFP 발현 대조군 반응을 위해 1.5mL 튜브에 따로 보관합니다(아래 참조). 공급 용액을 준비하십시오. 사료 혼합 병에 메티오닌이 없는 재구성 아미노산 혼합물 2.65mL와 재구성 메티오닌 300μL를 추가합니다. 롤링/부드럽게 흔들어 녹입니다.알림: 이때 사용하지 않은 재구성 완충액과 메티오닌은 냉동실에 넣어 보관할 수 있습니다. 반응 용액 1 mL를 무세포 반응 키트에 제공된 내부 반응 챔버로 옮기고 채워지면 밀봉한다. 10 mL의 공급 용액을 반응 용기의 외부 챔버로 옮기고 밀봉한다.알림: 챔버를 과도하게 채우지 마십시오! 내부 반응 챔버와 내부 공급 챔버 모두의 상단에 기포가 존재하면 반응에 악영향을 미칩니다. 나머지 반응 용액을 1.5mL 튜브에 넣고 주 용기와 함께 혼합할 수 있습니다. 이전에 분취된 20 μL 반응 혼합물에 0.5 μL의 GFP 대조군 플라스미드(0.5 mg/mL)를 추가합니다.참고: 많은 키트에는 품질 관리 목적으로 대조 플라스미드가 함께 제공됩니다. T7 프로모터 및 E.coli 리보솜 결합 부위(RBS)를 갖는 대부분의 GFP 발현 플라스미드는 또한 대조군 플라스미드로서 사용될 수 있다. 300rpm, 30°C에서 최대 18시간 동안 진탕기에 반응물을 넣습니다. 반응이 성공적이었는지 확인하려면 UV 광원을 사용하여 배양 15분 후 대조군 GFP(그림 1A)의 합성으로 인한 형광을 확인했습니다.참고: 이러한 조건, 특히 온도는 다른 막 단백질의 발현을 위해 최적화되어야 할 수 있습니다. 5. MOMP-tNLP 정제 고정화된 니켈 친화성 크로마토그래피를 사용하여 Δ49ApoA1 단백질에 His-tag를 사용하여 무세포 반응 혼합물로부터 MOMP-tNLP 나노입자 복합체를 정제합니다.His-Tag 정제 수지의 50% 슬러리 1mL를 일회용 10mL 크로마토그래피 컬럼으로 옮기고 3mL의 결합 완충액으로 평형을 이룹니다. 버퍼를 배수하고 배출구를 덮은 다음 250μL의 결합 버퍼를 수지에 추가합니다. cell-free 반응을 컬럼에 추가하기 전에 SDS-PAGE에 의한 추후 분석을 위해 20 μL를 저장한다. 무세포 반응물을 평형화된 수지와 혼합하고 4°C의 실험실 로커에서 1시간 동안 배양합니다. 컬럼의 캡을 열고 500μL의 추가 결합 완충액으로 캡을 세척한 후 이 액체를 컬럼의 나머지 부분에 추가합니다. SDS-PAGE에 의한 추후 분석을 위해 컬럼에서 액체 유동을 수집합니다. 20 mM 이미다졸을 함유하는 세척 완충액 1 mL로 컬럼을 6회 세척하고 분획을 수집한다. 세탁 사이에 수지가 마르지 않도록 주의하십시오. 두 번째 세척 시 1mL 피펫을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 수지를 세게 교반합니다. 용출 완충액 1(250mM 이미다졸 함유)의 300μL 분획 6개에서 MOMP-tNLP를 용리한 후 300μL의 용출 완충액 2(500mM 이미다졸 함유)로 최종 용출합니다. 두 번째 용출 시, 1mL 피펫을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 수지를 세게 교반합니다. 6. SDS-PAGE에 의한 분석 참고: 모든 용출 분획은 SDS-PAGE로 분석하여 관심 단백질의 양과 순도를 선별해야 합니다. 총 용해물과 플로우 스루에 각각 1μL를 로드한 다음 수집된 모든 세척 및 용출 분획에 대해 5μL를 로드합니다.용리된 MOMP–tNLPs, 세척, 플로우 스루 및 총 용해물의 분취량을 4x SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼와 혼합합니다. 달리 명시되지 않는 한 샘플을 10x 샘플 환원제로 혼합하고 열 변성합니다. 적절한 분자량 표준물질과 함께 1x MES-SDS 실행 완충액이 있는 1.0mm, 4 내지 12% Bis-Tris SDS-PAGE 겔을 사용하여 겔 전기영동으로 분획을 분석합니다. 200V에서 35분 동안 젤을 실행합니다. 제조업체의 지침에 따라 젤을 얼룩지게하십시오.카세트에서 젤을 제거하고 60mL의 젤 얼룩에 넣습니다. 젤 스테인에 젤을 전자레인지에 30초 동안 돌리고 용기를 30초 동안 부드럽게 흔들어 열을 고르게 분산시킵니다. 얼룩에 있는 젤을 전자레인지에 80–85°C로 30초 더 돌리고 젤을 오비탈 셰이커에 올려 5분 동안 흔들어 놓습니다. 젤을 전자레인지에 30초 동안 세 번 돌린 다음 궤도 셰이커로 돌아가 23분 더 돌립니다. 겔을 깨끗한 용기에 옮기고 100mL의 세척 용액(10% 메탄올, 7% 아세트산)에서 30분 동안 세척합니다.알림: 이것은 세척 용액을 가열하지 않는 것이 필수적이므로 중요한 단계입니다. 그렇게 하지 않으면 최종 젤 이미지에서 배경 얼룩과 불규칙성이 발생할 수 있습니다. 세척 후 초순수로 젤을 각각 5분씩 두 번 헹굽니다. 600nm에서 겔 이미저를 사용하여 겔을 이미지화합니다(그림 2). 비교를 위한 단백질 표준이 있는 경우 SDS-PAGE를 사용하여 나노입자 용액에서 개별 단백질의 양을 정량화합니다.참고: 이 예에서ample, 재조합적으로 발현된 MOMP의 연속 희석은 SDS-PAGE에 의해 해결되고 밴드의 밀도는 기기 소프트웨어를 사용하여 정량화됩니다. MOMP 대역의 밀도를 사용하여 표준 곡선을 생성합니다. 동일한 SDS-PAGE 겔에서 MOMP-tNLP 시료를 분해하고 MOMP 표준 곡선을 사용하여 입자의 MOMP 성분을 계산합니다 (그림 3). 7. 서양 및 도트 얼룩 및 보관 웨스턴 블로팅의 경우, SDS-PAGE로 샘플을 분리하고 제조업체의 프로토콜에 따라 표준 설정을 가진 상업용 건식 블로팅 시스템을 사용하여 겔을 옮깁니다.전사가 완료된 후 스택으로부터 블롯을 제거하고, 각각의 블롯을 0.2% 트윈 20 및 0.5 mg/mL MAb40 또는 0.2 mg/mL MAbHIS 항-태그 항체를 함유하는 적합한 블로킹 완충액에서 4°C에서 밤새 인큐베이션한다.참고: 블롯팅에 사용되는 항체 희석액은 MAb40의 경우 1:1,000, MAbHIS 항체의 경우 1:500–1,000입니다. 각 블롯을 PBS-T(1x PBS, 0.2% 트윈 20, pH 7.4)로 5분 동안 3회 세척합니다. 형광단(예: IRDye)에 접합된 2차 항체를 1:10,000 희석으로 함유하는 블로킹 완충액에서 1시간 동안 블롯을 인큐베이션합니다. PBS-T로 5분 동안 블롯을 3회 다시 세척합니다. 형광 이미저를 사용하여 최종 세척 후 얼룩을 이미지화합니다. 도트 블롯의 경우, 정제된 MOMP-tNLP 3 μg과 빈 tNLP를 도트 블롯 장치를 이용하여 블롯하였다. 웨스턴 블로팅을 위해 상술한 것과 동일한 방법을 사용하여 블롯을 차단하고 현상한다. 8. 내독소 평가 Limulus Amebocyte Lysate(LAL) 분석을 기반으로 하는 내독소 검사 시스템을 사용하여 내독소 수준을 정량화합니다. 1M Tris 염산염 용액과 내독소가 없는 물을 사용하여 내독소가 없는 25mM Tris, pH 7.4, 샘플 버퍼를 준비합니다.참고: 일반적으로 samples는 이 s를 사용하여 희석해야 합니다.ample 버퍼, 그리고 개별 s에 적합한 범위를 찾기 위해 희석액을 조정amp르. 여기서 MOMP-tNLP 샘플은 샘플 버퍼에서 500배 희석되고 25μL는 0.05EU/mL 감도로 장치 카트리지의 각 웰에 로드됩니다. 아래에 설명된 마우스 연구에 사용된 MOMP-tNLP 및 빈 tNLP의 내독소 수준은 샘플에 따라 0.4에서 12 EU/μg 단백질 사이입니다. 9. 동결건조 MOMP-tNLP 나노입자를 -20°C에서 장기간(최대 수년) 사용하기 위해 동결건조하여 보관한다. 동결건조를 위한 tNLP 및 MOMP-tNLP 현탁액을 제조하기 위해, 동결 및 동결건조 과정에서 보호제로 트레할로스를 첨가한다.참고: 이 공정은 다양한 tNLP 제형 7,8에 대해 광범위하게 검증되었습니다. MOMP-tNLP 용액의 현재 부피를 9로 나누어 0.1 M 트레할로스의 최종 농도에 도달하는 데 필요한 멸균, 내독소가 없는, 탈이온수에서 1 M 트레할로스의 부피를 얻는다. 최종 부피를 기록하고 원하는 대로 내독소가 없는 15mL 또는 50mL 폴리프로필렌 튜브에 분취량을 넣습니다. 혼합 용액을 드라이아이스에 동결하고 동결건조기를 사용하여 밤새 동결건조한다. 건조된 제형을 필요할 때까지 -20°C에서 보관한다. 내독소가 없는 물을 사용하여 동결건조된 tNLP를 재구성합니다. 동결건조된 케이크가 완전히 용해되고 재수화될 때까지 부드럽게 굴립니다. 트레할로스를 제거하기 위해, 3.5 kDa 컷오프 투석막을 사용하여 PBS에 대해 용액을 투석한다. 10. 보조제 첨가 참고: 이들 및 기타 유사한 NLP 기반 서브유닛 백신 제형은 CpG-ODN1826 및 FSL-1과 같은 친유성 보조제를 쉽게 통합할 수 있습니다. CpG-ODN1826은 5′ 콜레스테롤 부분(5′-chol-C6)을 특징으로 하는 완전한 포스포로티오에이트 골격을 가진 변형된 클래스 B CpG 올리고뉴클레오티드(5′-tccatgacgttcctgacgtt-3′)입니다. tNLP에 대한 CpG-ODN1826의 접합은 콜레스테롤 부분과 tNLP의 인지질 이중층 사이의 소수성 상호작용에 의해 매개되며, 이전에 보고된 바와 같이 입증되고 잘 특성화되었다 9,10. 이러한 제형에 혼입하기 전에 역상 크로마토그래피로 콜레스테롤 변형 CpG를 정제하여 오염된 내독소 및 변형되지 않은 CpG 분자를 제거합니다.공급업체로부터 수령 시 동결건조된 CpG 물질을 내독소가 없는 물에서 재수화하고 10mM 트리에틸암모늄 아세테이트(TEAA)(이동상 A) 및 아세토니트릴(이동상 B)로 구성된 분리 구배를 사용하여 분취용 C4 RP-HPLC 컬럼에서 정제합니다.참고: 자세한 내용은 표 2에서 확인할 수 있습니다. 콜레스테롤 변형 CpG를 함유한 분획을 풀링하고 동결건조합니다. 잔류 TEAA를 완전히 제거하려면 CpG를 15mL의 내독소가 없는 물로 재구성하고 3회 재동결건조합니다. 최종 동결건조 후 CpG를 내독소가 없는 물(>20mg/mL 최종 CpG 농도)으로 재구성하고 분취하고 필요할 때까지 -80°C에서 보관합니다. 제형 외에 CpG를 1–2.5 mg/mL의 농도로 희석하십시오.참고: FSL-1은 백신 등급의 동결건조 분말로 제공됩니다. 이것은 1mg/mL 농도의 멸균 및 내독소가 없는 물을 사용하여 재구성됩니다. 백신은 근육내(i.m)로 투여되며, 각 용량은 총 부피 50μL에 10μg의 MOMP를 함유합니다. 원하는 제형 용량을 얻으려면 나노 입자를 PBS로 투석하고 보조제 첨가 전에 원심 진공 농축기를 사용하여 농축합니다. 샘플이 완전히 건조되지 않도록 이 작업을 수행할 때 주의하십시오 – 원심분리 중에 20-30분마다 샘플 부피를 확인하십시오. 생물 안전 캐비닛에 멸균 조건에서 보조제를 추가합니다. 성공적인 통합을 평가하려면 분석 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 최종 제형과 그 성분을 분석하십시오.참고: 이러한 준비를 위해 PBS 버퍼(유속 0.5mL/m)에서 SEC 컬럼을 사용하고 UV-vis 다이오드 어레이 검출기를 사용하여 용출을 검출했습니다. 혼입은 214 및 280 nm에서 보조제된 입자의 흡수와 보조제가 없는 입자의 흡수를 비교하여 평가되었습니다. 동물 사용 전에 보조제가 있는 MOMP-tNLP와 빈 tNLP를 4°C에서 최대 14일 동안 보관하십시오. 새로운 tNLP 제형의 안정성을 완전히 평가하기 위해 SEC에 의해 저장된 tNLP를 주기적으로 분석합니다.참고: 안정성은 제형마다 다릅니다. 11. 혈청 검사 암컷 3주령 마우스(BALB/c, n = 6)를 얻습니다. 5 μg의 CpG 및 1 μg FSL-1 (주사 당 총 부피 = 50 mL)로 보조된 MOMP-tNLP의 형태로 10 μg의 MOMP로 각 뒷다리에 마우스를 근육 내 (im) 접종한다. 예방 접종 후, 흉골 누운 상태를 유지할 수있을 때까지 생쥐를 관찰하십시오. 초기 백신 접종 (프라임) 4 주 후, 5 μg의 CpG 및 1 μg FSL-1 (주사 당 총 부피 = 50 mL)로 보조된 MOMP-tNLP의 형태로 10 μg의 MOMP로 두 번째 (부스트) 동물에게 백신을 접종한다. 초기 백신 접종 후 56일째에 혈액을 채취하여 항체 역가를 평가합니다. 자일라진(체중 0.3mg/20g)과 케타민(체중 3.0mg/20g) 용액을 주입하여 마우스를 마취하는 것으로 시작합니다. 앞다리와 뒷다리를 꼬집어 경련이 발생하지 않도록 합니다. 마취 중 눈의 건조를 방지하기 위해 눈 주위에 바셀린을 바르십시오. 미세 헤마토크릿 모세관을 사용하여 retro-orbital plexus에 구멍을 뚫습니다. 미세 원심 분리기 튜브에 혈액 100mL를 수집합니다. 채혈 후 마취에서 회복되고 흉골 누운 상태를 유지할 수있을 때까지 마우스를 관찰하십시오. 혈전을 실온에서 30분 동안 방치한 다음 2,000× g 에서 10분 동안 회전시킵니다. 혈청을 수집하고 -80°C에서 동결합니다. 이때 클라미디아 무리다룸 으로 동물에게 도전하거나 안락사시킨다. 먼저 i.p. 자일라진(체중 0.3mg/20g)과 케타민(체중 3.0mg/20g) 용액을 주사한 후 경추 탈구를 합니다. 상기와 같이 웨스턴 블롯팅 기술을 사용하여 MOMP에 특이적인 혈청 항체를 테스트합니다. 면역화된 모든 마우스에서 마우스 혈청을 풀링하고 1차 항체 대신 풀링된 혈청을 1:5,000 희석으로 사용합니다.