Preparación de muestras utilizando un método de monocapa lipídica para estudios cristalográficos de electrones

La difracción de electrones a través de cristales 2D o matrices helicoidales de proteínas puede lograr resoluciones subnanométricas en casos favorables^1,2,3. De particular interés son las matrices reconstituidas de proteínas de membrana 2D o cristales en sus entornos casi nativos¹. Debido a que un cristal actúa como un amplificador de señal que mejora las intensidades de los factores estructurales a frecuencias espaciales específicas, la cristalografía electrónica permite sondear un objetivo con un tamaño más pequeño a altas resoluciones, como moléculas pequeñas, que las de la crio-EM de una sola partícula. El haz de electrones puede ser difractado por una matriz ordenada 2D de proteínas, generando un patrón de difracción o una imagen de red dependiendo de dónde se registre el plano de la imagen en el detector⁴. Las intensidades difractadas se pueden extraer y procesar para reconstruir una estructura de proyección 2D del cristal. Los electrones tienen una sección transversal de dispersión más grande que los rayos X y su dispersión sigue principalmente el modelo de Rutherford basado en la interacción de Coulomb entre los electrones y los átomos cargados en la molécula⁵. Los espesores de los cristales de membrana 2D suelen ser inferiores a 100 nm, adecuados para la transmisión de electrones sin dispersión dinámica que ocurre dentro de la muestra^6. Se ha demostrado que los estudios cristalográficos electrónicos son una herramienta poderosa para sondear información estructural de alta resolución de proteínas de membrana e interacciones lípido-proteína^{7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.}

Una monocapa lipídica es una sola capa lipídica compuesta de fosfolípidos densamente empaquetados en una interfaz aire-agua⁶, que puede ayudar a la formación de la matriz 2D para proteínas solubles o proteínas de membrana periférica¹⁸. Dependiendo de la densidad de los lípidos y su presión lateral, las moléculas lipídicas pueden formar una matriz 2D ordenada en la interfaz aire-agua con sus cadenas de acilo extendidas al aire y grupos de cabeza hidrofílicos expuestos en la solución acuosa^1,6,19. El grupo de cabeza lipídica puede interactuar con las proteínas a través de la interacción electrostática o puede modificarse para proporcionar una etiqueta de afinidad para unirse a un dominio proteico específico. Por ejemplo, el DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]^2- Ni²⁺) se utiliza a menudo en la formación de una monocapa lipídica para unir las proteínas con una etiqueta de poli-histidina^20,21,22. Además, la toxina B del cólera puede unirse a un pentasacárido particular del gangliósido GM1 en una monocapa lipídica para estudios estructurales^23,24. Al anclar las proteínas en los grupos de cabeza de lípidos, la monocapa lipídica puede ayudar a la formación de las matrices 2D que son delgadas para estudios cristalográficos de electrones de alta resolución. La técnica de monocapa lipídica se ha utilizado en cristalografía electrónica para estudios estructurales de proteínas, como la estreptavidina^2,25,la anexina V^26,la toxina del cólera^27,la subunidad²⁸de la E. coli girasa B, la ARN polimerasa^25,29,30,las proteínas de la cubierta del carboxisoma³¹ y las proteínas de la cápside del VIH-1³² y el virus ^{de la leucemia murina de Moloney 33}. Debido a la estabilidad y propiedad química de la monocapa lipídica, se han explorado diferentes aplicaciones para la preparación de muestras para la obtención de imágenes crio-EM³⁴. Sin embargo, la optimización será necesaria para la formación de matrices de proteínas.

Aquí, proporcionamos detalles extensos de la preparación general de monocapas lipídicas para imágenes crio-EM y algunas consideraciones que podrían afectar la calidad de las monocapas formadas.