Preparação da amostra usando um método de monocamadas lipídica para estudos cristalográficos eletrônicos

A difração eletrônica através de cristais 2D ou matrizes helicoidais de proteínas podem alcançar resoluções subnômetros em casos favoráveis^1,2,3. De particular interesse são matrizes de proteína de membrana 2D reconstituídas ou cristais em seus ambientes quase nativos¹. Como um cristal age como um amplificador de sinal aumentando a intensidade dos fatores estruturais em frequências espaciais específicas, a cristalografia eletrônica permite sondar um alvo com um tamanho menor em altas resoluções, como pequenas moléculas, do que aquelas para crio-EM de uma única partícula. O feixe de elétrons pode ser difracionado por uma matriz 2D ordenada de proteínas, gerando um padrão de difração ou uma imagem de rede, dependendo de onde o plano de imagem é gravado no detector⁴. As intensidades ditracadas podem então ser extraídas e processadas para reconstruir uma estrutura de projeção 2D do cristal. Os elétrons têm uma seção transversal de dispersão maior do que os raios-X e sua dispersão segue principalmente o modelo rutherford baseado na interação coulomb entre os elétrons e os átomos carregados na molécula⁵. As espessuras dos cristais de membrana 2D são geralmente inferiores a 100 nm, adequadas para transmissão eletrônica sem dispersão dinâmica ocorrendo dentro da amostra⁶. Estudos cristalográficos eletrônicos têm se mostrado uma poderosa ferramenta para sondar informações estruturais de alta resolução de proteínas de membrana e interações lipídica-proteínas^{7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17}.

Uma monocamada lipídica é uma única camada lipídica composta de fosfolipídios densamente embalados em uma interface ar-água⁶, que pode auxiliar a formação de matriz 2D para proteínas solúveis ou proteínas de membrana periférica¹⁸. Dependendo da densidade dos lipídios e de sua pressão lateral, as moléculas lipídicas podem formar uma matriz 2D ordenada na interface ar-água com suas correntes de aciis estendidas ao ar e grupos de cabeça hidrofílicos expostos na solução aquosa^1,6,19. O headgroup lipídico pode interagir com proteínas através da interação eletrostática ou pode ser modificado para fornecer uma etiqueta de afinidade para ligar um domínio proteico específico. Por exemplo, os DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn -glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)imino ácido diacético)succinyl]^2- Ni²⁺) é frequentemente usado na formação de uma monocamada lipídica para ligar as proteínas com uma tag poli-histidina^20,21,22. Além disso, a toxina da cólera B pode ligar um pentasacarídeo particular do ganglioside GM1 em uma monocamada lipídica para estudos estruturais^23,24. Ancorando as proteínas nos grupos de cabeça lipídicos, a monocamada lipídica pode auxiliar na formação das matrizes 2D que são finas para estudos cristalográficos de alta resolução. A técnica de monocamadas lipídica tem sido usada na cristalografia eletrônica para estudos estruturais de proteínas, tais como streptavidin^2,25, anexo V²⁶, cólera toxina²⁷, E. coli gyrase B subunit²⁸, E. coli RNA polymerase^25,29,30, carboxysome shell proteins³¹ e as proteínas capsid do vírus ^{HIV-1 32 e Mol muroneyine leucemia 33}. Devido à estabilidade e propriedade química da monocamide lipídica, diferentes aplicações para preparação da amostra foram exploradas para a imagem crio-EM³⁴. No entanto, a otimização será necessária para a formação de matrizes proteicas.

Aqui, fornecemos extensos detalhes da preparação geral de monocamadas lipídicas para imagens crio-EM e algumas considerações que podem afetar a qualidade das monocamadas formadas.