Durchflusszytometrische Analyse zur Identifizierung der angeborenen und adaptiven Immunzellen der murinen Lunge

Die murinen Atemwege enthalten ein einzigartiges Immunsystem, das für die Bekämpfung von Krankheitserregern und die Aufrechterhaltung der Immunhomöostase verantwortlich ist. Das pulmonale Immunsystem besteht aus zellulären Populationen mit signifikanter Heterogenität in ihrem Phänotyp, ihrer Funktion, ihrem Ursprung und ihrem Standort. Residente alveoläre Makrophagen (AMs), die hauptsächlich aus fetalen Monozyten stammen, befinden sich im alveolären ^Lumen1, während sich aus dem Knochenmark stammende interstitielle Makrophagen (IMs) im Lungenparenchym ^befinden2. Sofortnachrichten können durch den Ausdruck CD206 weiter unterteilt werden. CD206⁺ IMs bevölkern den peribronchialen und perivaskulären Bereich, während sich CD206-IMs am alveolären Interstitium ^befinden3. In jüngster Zeit wurden einige Unterklassifizierungen von Sofortnachrichten vorgeschlagen3,4,5,6. Obwohl IMs weniger untersucht werden als AMs, unterstützen jüngste Beweise ihre entscheidende Rolle bei der Regulierung des Immunsystems der ^Lunge7. Darüber hinaus wird CD206 auch in alternativ aktivierten ^AMs8 ausgedrückt.

Pulmonale dendritische Zellen (DCs) sind eine weitere heterogene Gruppe von Lungenimmunzellen in Bezug auf ihre funktionellen Eigenschaften, ihren Ort und ihre Herkunft. Vier Unterkategorien von DCs wurden in der Lunge beschrieben: konventionelle CD103+ DCs (auch bekannt als cDC1), konventionelle CD11b⁺ DCs (auch bekannt als cDC2), Monozyten-abgeleitete DCs (MoDCs) und plasmazytoide DCs9,10,11,12,13. Die ersten drei Unterklassen können als Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) ^II+CD11c⁺9,10,14,15 definiert werden. Plasmazytoide DCs exprimieren MHC II und sind mittelmäßig positiv für CD11c, exprimieren aber hohe Konzentrationen von B220 und ^{PDCA-19,13,16}. In naiven murinen Lungen befinden sich CD103-DCs und CD11b-DCs im Interstitium der Atemwege, während sich plasmazytoide DCs im alveolären Interstitium ^befinden17.

Zwei Hauptpopulationen von Monozyten befinden sich im stationären Zustand in der Lunge: klassische Monozyten und nicht-klassische Monozyten. Klassische Monozyten sind Ly6C ⁺ und sind entscheidend für die anfängliche Entzündungsreaktion. Im Gegensatz dazu sind nicht-klassische Monozyten Ly6C^– und wurden weithin als entzündungshemmende Zellen angesehen3,16,18^. Kürzlich wurde eine zusätzliche Population von CD64⁺CD16.2+ Monozyten beschrieben, die aus Ly6C^– Monozyten stammen und CD206^{+ IMs3} entstehen lassen.

Eosinophile treten hauptsächlich in der Lunge während einer Helmintheninfektion oder allergischen Erkrankungen auf. Es gibt jedoch eine kleine Anzahl von Eosinophilen im Lungenparenchym während des stationären Zustands, die als ansässige Eosinophile bekannt sind. Im Gegensatz zu den ansässigen Eosinophilen finden sich entzündliche Eosinophile im Lungeninterstitium und in der bronchoalveolären Lavage (BAL). In Mausmodellen der Hausstaubmilbe (HDM) werden entzündliche Eosinophile nach Antigen-vermittelter Stimulation in die Lunge rekrutiert. Es wurde vorgeschlagen, dass ansässige Eosinophile eine regulatorische Rolle bei der Allergie spielen könnten, indem sie die Sensibilisierung von T helper 2 (Th2) gegenüber ^HDM19 hemmen.

Im Gegensatz zum Rest der lungenmyeloischen Zellen exprimieren Neutrophile Ly6G, aber nicht CD68 und zeichnen sich durch eine Signatur des CD68-Ly6G+^–Immunphänotyps16,20,21 aus. Visualisierungsstudien haben gezeigt, dass die Lunge im stationären Zustand einen Pool von Neutrophilen im intravaskulären Kompartiment reserviert und eine beträchtliche Anzahl extravaskulärer Neutrophilen ^{beherbergt22.} Ähnlich wie Eosinophile werden Neutrophile in BAL im stationären Zustand nicht gefunden; Verschiedene Formen der Immunstimulation, wie LPS-Challenge, Asthma oder Lungenentzündung, treiben jedoch Neutrophile in das Alveolarlumen, was zu ihrer Anwesenheit in BAL21,22,23 führt.

Eine beträchtliche Anzahl von CD45⁺-Zellen der Lunge stellt einen natürlichen Killer (NK), T-Zellen und B-Zellen dar und ist für die meisten myeloischen Marker ^negativ24. In den Lungen naiver Mäuse können diese drei Zelltypen anhand der Expression von CD11b und MHC ^II18 identifiziert werden. Etwa 25% der pulmonalen CD45⁺-Zellen sind B-Zellen, während der Prozentsatz der NK-Zellen in der Lunge höher ist als bei anderen lymphatischen und nicht-lymphatischen Geweben24,25,26. Unter den pulmonalen ^T-Zellen ist ein beträchtlicher Anteil CD4-CD8^– und spielt eine wichtige Rolle bei Atemwegsinfektionen26.

Da die Lunge ein sehr komplexes und einzigartiges Immunsystem beherbergt, wurden mehrere Gating-Strategien zur Identifizierung von Lungenimmunzellen entwickelt und berichtet16,18,20,27. Die hierin beschriebene Gating-Strategie bietet eine umfassende und reproduzierbare Möglichkeit, bis zu 12 verschiedene pulmonale myeloische und nicht-myeloische Immunpopulationen mit 9 Markern zu identifizieren. Zusätzliche Marker wurden verwendet, um die Ergebnisse zu validieren. Darüber hinaus wird eine detaillierte Methode zur Herstellung einer Einzelzellsuspension bereitgestellt, die den Zelltod minimiert und die Identifizierung des vollständigsten Profils des Immunzellkompartiments der Lunge ermöglicht. Es sollte beachtet werden, dass die Identifizierung von Nicht-Immunzellen der Lunge, wie Epithelzellen (CD45-CD326⁺CD31^–), Endothelzellen (CD45-CD326-CD31⁺), und Fibroblasten einen anderen Ansatz ^{erfordert28,29}. Die Identifizierung solcher Populationen ist in dem hier beschriebenen Protokoll und Verfahren nicht enthalten.