Primer mikroglia kültürleri, yeni anti-enflamatuar molekülleri değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Mevcut protokol, mikroglia’yı yenidoğan yavrulardan manyetik olarak izole etmek için tekrarlanabilir ve ilgili bir yöntemi tanımlamaktadır.
Mikroglia, beyinde yerleşik makrofajlar olarak, çevresel strese ve beyin homeostazına yanıt da dahil olmak üzere çeşitli işlevlerin temelidir. Mikroglia, geniş bir aktivasyon fenotipi spektrumunu benimseyebilir. Ayrıca, pro-inflamatuar fenotipi destekleyen mikroglia hem nörogelişimsel hem de nörodejeneratif bozukluklarla ilişkilidir. İn vitro çalışmalar, spesifik hücre tiplerinde potansiyel terapötik stratejileri değerlendirmek için araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu bağlamda, primer mikroglial kültürleri kullanarak in vitro mikroglial aktivasyon ve nöroinflamasyonu incelemek, mikroglial hücre hatlarından veya kök hücre kaynaklı mikroglialardan daha önemlidir. Bununla birlikte, bazı birincil kültürlerin kullanımı tekrarlanabilirlik eksikliğinden muzdarip olabilir. Bu protokol, mikroglia’yı yenidoğan yavrulardan manyetik olarak izole etmek için tekrarlanabilir ve ilgili bir yöntem önermektedir. Burada mRNA ekspresyon nicelemesi ve Cy3-boncuk fagositik testi ile 4 saat ve 24 saat sonra birkaç uyaran kullanılarak mikroglial aktivasyon gösterilmiştir. Mevcut çalışmanın, fizyolojik olarak ilgili mikroglia’yı juvenil gelişim aşamalarından izole etmek için kolayca tekrarlanabilir bir teknik sağlaması beklenmektedir.
Mikroglia, erken embriyonik gelişim sırasında nöroepitelyuma göç eden yumurta sarısı kesesinin eritropoetik öncüllerinden türetilen merkezi sinir sistemi yerleşik makrofaj benzeri hücrelerdir1. Bağışıklık fonksiyonlarının yanı sıra, nörogelişim sırasında, özellikle sinaptogenez, nöronal homeostaz ve miyelinasyon2 için önemli bir rol oynarlar. Yetişkinlikte, mikroglia çevreyi sürekli taramak için uzun hücresel süreçler geliştirir. Beyin hasarı veya beyin hastalığı gibi homeostaz rüptürleri durumunda, mikroglia morfolojik görünümlerini amip şeklini benimsemek, yaralı bölgeye göç etmek, birçok sitoprotektif veya sitotoksik faktörü artırmak ve serbest bırakmak için değiştirebilir. Mikroglia, gelişim evrelerine ve devam eden yaralanma tipine bağlı olarak heterojen aktivasyon durumlarına sahiptir 3,4,5. Bu çalışmada, bu aktivasyon durumları genel olarak üç farklı fenotipte sınıflandırılmıştır: pro-enflamatuar / fagositik, anti-enflamatuar ve immüno-düzenleyici, gerçekte durumundaha karmaşık olması muhtemel olduğunu akılda tutarak6.
Beyin gelişiminin erken aşamalarında in vivo mikroglial aktivasyonu ve nöroprotektif stratejilerin taranmasını incelemek, (1) sütten kesilmeden önce hayvanların kırılganlığı ve (2) mikroglial hücrelerin sayısının az olması nedeniyle zor olabilir. Bu nedenle, mikroglia üzerine yapılan in vitro çalışmalar toksisite 7,8,9, nöroprotektif stratejiler5,10,11,12,13,14 ve ko-kültürler 15,16,17,18,19,20,21 için yaygın olarak kullanılmaktadır. . In vitro çalışmalar mikroglial hücre hatlarını, kök hücre kaynaklı mikrogliayı veya birincil mikroglia kültürünü kullanabilir. Tüm bu yaklaşımların avantajları ve dezavantajları vardır ve seçim ilk biyolojik soruya bağlıdır. Birincil mikroglia kültürlerini kullanmanın faydaları, homojen genetik arka plan, patojensiz öykü ve hayvan ölümünden sonra mikroglianın uyarıldığı zamanın kontrolüdür22.
Yıllar geçtikçe, hem yenidoğan hem de yetişkin 23,24,25,26,27,28,29 kemirgenlerinden birincil mikroglia kültürlenmesi için farklı yöntemler (akış sitometrisi, sallama veya manyetik etiketleme) geliştirilmiştir. Bu çalışmada, fare yenidoğan yavrularından mikroglia izolasyonu, mikroboncuk kaplı anti-fare CD11b25,27,29 kullanılarak daha önce tarif edilen manyetik aktive hücre sıralama teknolojisi kullanılarak gerçekleştirilmektedir. CD11b, mikroglia da dahil olmak üzere miyeloid hücrelerin yüzeyinde eksprese edilen bir integrin-reseptörüdür. Beyinde enflamatuar bir zorluk olmadığında, neredeyse tüm CD11b + hücreleri mikroglia30’dur. Daha önce yayınlanmış diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında 23,24,25,26,27,28,29, mevcut protokol acil ex vivo mikroglial aktivasyon analizlerini ve yaygın in vitro primer mikroglial kültürü dengelemektedir. Bu nedenle, mikroglia (1) doğum sonrası günde (P) 8’de miyelin çıkarılması olmadan izole edilir, (2) serum olmadan kültürlenir ve (3) beyin izolasyonundan sadece 48 saat sonra siRNA, miRNA, farmakolojik bileşik ve / veya enflamatuar uyaranlara maruz kalır. Bu üç yönün her biri, mevcut protokolü alakalı ve hızlı hale getirir. Her şeyden önce, pediatrik mikroglia kullanımı, in vitro mikroglial reaktiviteyi potansiyel olarak değiştirebilecek ek bir demiyelinizasyon adımı gerektirmeden kültürde dinamik ve reaktif canlı hücrelerin elde edilmesini sağlar. Mevcut protokol, mikroglia’nın fizyolojik ortamına mümkün olduğunca yaklaşmayı amaçlamaktadır. Gerçekten de, mikroglia asla serum ile karşılaşmaz ve bu protokol de serum kullanımını gerektirmez. Dahası, mikroglia’yı kültürden sonra 48 saat kadar erken bir sürede açığa çıkarmak, fizyolojik fakültelerini kaybetmelerini önler.
Mevcut çalışma, manyetik olarak sıralanmış CD11b + hücrelerini kullanarak birincil bir mikroglial hücre kültürü sunmaktadır. Mikroglial fonksiyonel değerlendirmeye (RT-qPCR ve fagositik tahliller) ek olarak, mikroglial kültür saflığı da belirlendi.
Klasik mikroglia hücre kültürleri genellikle P1 veya P2 kemirgen yenidoğan beyninden ve astrositlerle en az 10 gün boyunca ortak kültürden üretilir. Mikroglia daha sonra yörüngesel bir çalkalayıcı kullanılarak mekanik…
The authors have nothing to disclose.
Figürler BioRender kullanılarak oluşturulmuştur. Araştırma, Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco ve Investissement d’Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS and Investissement d’Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E. tarafından finanse edilmektedir.
Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
Neural Tissue Dissociation Kit – Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
OPTILUX Petri dish – 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |