Le colture primarie di microglia sono comunemente utilizzate per valutare nuove molecole anti-infiammatorie. Il presente protocollo descrive un metodo riproducibile e rilevante per isolare magneticamente la microglia dai cuccioli neonati.
Le microglia, come macrofagi residenti nel cervello, sono fondamentali per diverse funzioni, tra cui la risposta allo stress ambientale e l’omeostasi cerebrale. La microglia può adottare un ampio spettro di fenotipi di attivazione. Inoltre, le microglia che sostengono il fenotipo pro-infiammatorio sono associate a disturbi sia dello sviluppo neurologico che neurodegenerativi. Gli studi in vitro sono ampiamente utilizzati nella ricerca per valutare potenziali strategie terapeutiche in specifici tipi di cellule. In questo contesto, lo studio dell’attivazione microgliale e della neuroinfiammazione in vitro utilizzando colture microgliali primarie è più rilevante delle linee cellulari microgliali o delle microglia derivate dalle cellule staminali. Tuttavia, l’uso di alcune colture primarie potrebbe soffrire di una mancanza di riproducibilità. Questo protocollo propone un metodo riproducibile e rilevante per isolare magneticamente la microglia dai cuccioli neonati. L’attivazione microgliale utilizzando diversi stimoli dopo 4 ore e 24 ore mediante quantificazione dell’espressione dell’mRNA e un saggio fagocitico Cy3-bead è dimostrato qui. Il lavoro attuale dovrebbe fornire una tecnica facilmente riproducibile per isolare microglia fisiologicamente rilevanti dagli stadi di sviluppo giovanile.
Le microglia sono le cellule simili a macrofagi residenti nel sistema nervoso centrale derivate da precursori eritropoietici del sacco vitellino che migrano verso il neuroepitelio durante lo sviluppo embrionale precoce1. Oltre alle loro funzioni immunitarie, svolgono anche un ruolo significativo durante lo sviluppo neurologico, in particolare per la sinaptogenesi, l’omeostasi neuronale e la mielinizzazione2. In età adulta, le microglia sviluppano lunghi processi cellulari per scansionare continuamente l’ambiente. In caso di rotture dell’omeostasi come lesioni cerebrali o malattie cerebrali, le microglia possono cambiare il loro aspetto morfologico per adottare una forma ameboide, migrare verso l’area lesa, aumentare e rilasciare molti fattori citoprotettivi o citotossici. Le microglia hanno stati di attivazione eterogenei a seconda del loro stadio di sviluppo e del tipo di lesione subita 3,4,5. In questo studio, questi stati di attivazione sono ampiamente classificati in tre diversi fenotipi: pro-infiammatori / fagocitici, antinfiammatori e immuno-regolatori, tenendo presente che in realtà la situazione è probabilmente più complessa6.
Studiare in vivo l’attivazione microgliale e lo screening per le strategie neuroprotettive nelle prime fasi dello sviluppo cerebrale può essere difficile a causa (1) della fragilità degli animali prima dello svezzamento e (2) del basso numero di cellule microgliali. Pertanto gli studi in vitro sulle microglia sono ampiamente utilizzati per tossicità 7,8,9, strategie neuroprotettive5,10,11,12,13,14 e co-colture 15,16,17,18,19,20,21 . Gli studi in vitro possono utilizzare linee cellulari microgliali, microglia derivate da cellule staminali o colture di microglia primarie. Tutti questi approcci hanno vantaggi e svantaggi e la scelta dipende dalla domanda biologica iniziale. I vantaggi dell’utilizzo di colture primarie di microglia sono il background genetico omogeneo, la storia priva di agenti patogeni e il controllo del momento in cui le microglia vengono stimolate dopo la morte dell’animale22.
Nel corso degli anni, sono stati sviluppati diversi metodi (citometria a flusso, scuotimento o marcatura magnetica) per la coltura di microglia primaria da roditori, sia neonati che adulti 23,24,25,26,27,28,29. Nel presente lavoro, l’isolamento della microglia da cuccioli di topo neonato viene eseguito utilizzando la tecnologia di selezione cellulare attivata magneticamente precedentemente descritta utilizzando CD11b 25,27,29 anti-topo rivestito di microsfere. CD11b è un recettore dell’integrina espresso sulla superficie delle cellule mieloidi, compresa la microglia. Quando non c’è sfida infiammatoria all’interno del cervello, quasi tutte le cellule CD11b + sono microglia30. Rispetto ad altri metodi precedentemente pubblicati 23,24,25,26,27,28,29, il presente protocollo bilancia le analisi immediate di attivazione microgliale ex vivo e la comune coltura microgliale primaria in vitro. Pertanto, le microglia sono (1) isolate al giorno postnatale (P) 8 senza rimozione della mielina, (2) coltivate senza siero e (3) esposte a siRNA, miRNA, composti farmacologici e / o stimoli infiammatori solo 48 ore dopo l’isolamento cerebrale. Ciascuno di questi tre aspetti rende l’attuale protocollo rilevante e rapido. Innanzitutto, l’utilizzo della microglia pediatrica consente di ottenere cellule vitali dinamiche e reattive in coltura senza richiedere un ulteriore step demielinico che potrebbe potenzialmente modificare la reattività microgliale in vitro. Il presente protocollo mira ad avvicinarsi il più possibile all’ambiente fisiologico della microglia. In effetti, le microglia non incontrano mai il siero e questo protocollo non richiede nemmeno l’uso del siero. Inoltre, esporre le microglia già 48 ore dopo la coltura impedisce loro di perdere le loro facoltà fisiologiche.
Il lavoro attuale presenta una coltura primaria di cellule microgliali utilizzando cellule CD11b + ordinate magneticamente. Oltre alla valutazione funzionale microgliale (RT-qPCR e saggi fagocitici), è stata determinata anche la purezza della coltura microgliale.
Le colture cellulari di microglia classiche sono comunemente generate dal cervello neonato del roditore P1 o P2 e dalla co-coltura con astrociti per almeno 10 giorni. Le microglia vengono quindi separate meccanicamente utilizzando un…
The authors have nothing to disclose.
Le figure sono state create utilizzando BioRender. La ricerca è finanziata da Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco e una sovvenzione aggiuntiva da Investissement d’Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS e Investissement d’Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.
Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
Neural Tissue Dissociation Kit – Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
OPTILUX Petri dish – 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |