Tümör Makrodiseksiyonu ile Tümör İçeriğinin Arttırılması

FFPE dokuları sıklıkla tümörlü ve tümör dışı dokuların heterojen katkılarıdır. Yüksek duyarlılıklı genomik testler hem klinik hem de araştırma ortamlarında giderek daha yaygın hale gelmektedir, ancak tümör dışı dokuyu kirleten varlığıyla karıştırılabilir. Gerçekten de, genomik çalışmalar için minimum% 60’lık bir tümör içeriği sıklıkla önerilmektedir. Tümör yüzdesi, tümör materyalinin kapladığı doku alanına veya doku içindeki tümör hücrelerinin oranına göre belirlenebilir. Bölgeye göre tümör, tümör saflığı için yaygın olarak kullanılan bir metrik olmasına rağmen, her zaman dokunun doğru bir tanımını göstermez. Her ikisi de 1000 hücreli iki doku düşünün, bunların 500’ü tümör hücreleridir. Doku A’da, tümör olmayan 500 hücre, tümör hücresininkine benzer hacimlere sahip stromal hücrelerdir. Bu dokuda, tümör yüzdesi hem hücresellik hem de alan açısından% 50 olarak kabul edilebilir. B dokusunda, tümör olmayan 500 hücre, tümör hücresinin 4 katı hacimli yağ hücreleridir. Bu dokuda, tümör yüzdesi hala hücreselliğe göre% 50, ancak alana% 20’dir. Üçüncü bir doku olan C dokusu, 500 tümör hücresi artı 400 yağ hücresi ve 800 stromal hücreden oluşur ve hacimleri sırasıyla tümör hücrelerinin 4x ve 0.5x olanıdır. 100 yağ hücresinin 800 stromal hücrenin hacmine eşit olduğu göz önüne alındığında, C dokusunun tümör yüzdesi hücreselliğe göre% 29’dur (500/1700), ancak yine de alana% 20’dir. D dokusu ayrıca 1x, 4x ve 0.1x hacim oranlarına sahip tümör, yağ ve stromal hücrelerden oluşur. Ancak, hücre sayısı sırasıyla 400, 10 ve 720’dir. Böylece, D dokusunun tümör yüzdesi hücreselliğe göre %35 (400/1130) ancak alana göre %78’dir. Bu örnekler aşırı derecede basittir ve gerçek dünyadaki doku bileşimlerini yansıtmaz, ancak doku kompozisyonunun önemini ve tümör içeriği arasındaki farkı alana ve hücreselliğe göre açıkça ifade eder. Önemli olarak, aşağı akış nükleik asit ekstraksiyonu için tümör içeriğinin zenginleştirilmesi söz konusu olduğunda, tümör hücreselliği, tümör hücrelerinden daha fazla tümör dışı hücreden genomik materyal çıkarmanın artan kafa karıştırıcı potansiyeli nedeniyle daha önemli bir özelliktir. Bu sadece dokuların tümör içeriğini yüzde hücresellik açısından değerlendirme ihtiyacını değil, aynı zamanda tümör dışı dokunun olası olumsuz etkilerini en aza indirmek için istenmeyen dokuyu eksize etme ihtiyacını da vurgulamaktadır. Doku zenginleştirme için çeşitli yöntemler vardır, bunlardan başlıcaları makrodiseksiyon ve mikrodiseksiyondur.

Bu protokolde açıklanan yöntem olan makrodiseksiyon nispeten hızlı, basittir ve pahalı veya özel ekipman gerektirmez. Makrodiseksiyon tümör içeriğini büyük ölçüde iyileştirebilse de, tümör dışı materyali tamamen ortadan kaldırmadığını anlamak önemlidir. Makrodiseksiyonun amacı, istenmeyen dokudan kaynaklanan “gürültüyü” azaltmak için istenmeyen dokunun dışlanması yoluyla ilgilenilen dokuyu yeterince zenginleştirmektir, bu da ilgilenilen dokudan gelen ilgi sinyalini artırabilir. Bu nedenle, makrodiseksiyon aracılı tümör zenginleştirme, ilgilenilen belirteçleri, özellikle de düşük bolluğa veya zayıf ekspresyona sahip tümöre özgü moleküler belirteçleri daha iyi tespit etmek için sinyal-gürültü oranını arttırmanın bir yoludur. Bununla birlikte, makrodiseksiyon, tıraş bıçağı gibi kaba aletlerin sunduğu hassasiyet eksikliği nedeniyle sınırlamalara sahiptir ve patologun işaretleyicisinin çizgi kalınlığından kaynaklanan hassasiyet sorunlarına ve patologların H & E sınırlarını izlerken potansiyel hatalara karşı hassastır. Yukarıda belirtildiği gibi, tümörün içine gömülü doğal ve tümöre neden olan stromal elementlerin (yani bağ dokusu, stromal fibroblastlar, kan damarları, benign reaktif lenfositler, makrofajlar) varlığı nedeniyle% 100 tümör saflığı elde etmek mümkün değildir. Gerçekten de, birçok invaziv veya diffüz infiltratif malignite, stromal fibroblastlar ve diğer neoplastik olmayan hücre tipleri ile yakından karışmış tümör hücresi kümeleri ile sonuçlanan sağlam bir desmoplastik stromal yanıta neden olur; pankreas kanseri dokuları²¹ gibi bu stromal reaksiyon paterniyle ilişkili tümörlerin, manuel makrodiseksiyondan ziyade dijital olarak yönlendirilmiş mikrodiseksiyondan daha fazla fayda sağlayabileceği yerlerde.

Manuel mikrodiseksiyon, bir iğne veya neşter kullanarak dokulara özgü hücrelerin veya popülasyonların tanımlanmasına, diseksiyonuna ve izolasyonuna yardımcı olmak için mikroskop altında gerçekleştirilir ve makrodiseksiyon^22’ye göre artan hassasiyet avantajına sahiptir. Bununla birlikte, manuel mikrodiseksiyon, düşük tümör içeriğine veya manuel diseksiyonla uyumlu olmayan karmaşık özelliklere sahip karmaşık dokular için gereken incelikten yoksun zahmetli bir işlemdir. Bu tür dokular, lazer yakalama mikrodiseksiyonu gibi yüksek hassasiyetli otomatik yöntemler kullanılarak diseke edilebilir. Gerçekten de, dijital olarak yönlendirilen mikrodiseksiyonun, pankreas kanseri dokularında manuel makrodiseksiyona kıyasla daha yüksek oranda tümör içeriği sağladığı gösterilmiştir²³. Bununla birlikte, uzmanlaşmış, pahalı ekipmanlara ve yüksek eğitimli bireylere duyulan ihtiyaç gibi bu yüksek hassasiyetli otomatik yöntemlerin dezavantajları, iş akışlarına dahil edilmesini engellemiştir. Makrodiseksiyon ve lazer yakalama mikrodiseksiyonunun (LCM) gen ekspresyon profillemesi üzerindeki etkilerini karşılaştıran de Bruin ve ark. tarafından yapılan bir çalışmada, LCM örneklerinin düşük toplam RNA verimine (30 ng ortalama) sahip olduğu ve cDNA kütüphanesi hazırlık giriş eşiğini karşılamak için iki tur mRNA amplifikasyonu gerektirdiği bulunmuştur²⁴. Yazarlar, ortaya çıkan LCM gen ekspresyon profillerinin, makrodisseke edilmiş profillerin tümör dışı stromal katkılardan etkilendiğinden daha fazla mRNA amplifikasyon turlarından etkilendiğini bulmuş ve makrodiseksiyonun güvenilir gen ekspresyon verileri üretmek için yeterince kullanılabileceği sonucuna varmışlardır²⁴.

NanoString dijital gen ekspresyon profillemesinin önemli bir avantajı, özellikle yüksek oranda bozulmuş FFPE türevi RNA ile çalışırken, RNA amplifikasyonu veya cDNA kütüphanelerinin hazırlanması gibi enzimatik bağımlı süreçler gerektirmemesidir. Bununla birlikte, tahliller tipik olarak toplam RNA 25,26’nın 50-300 ng arasındaki girdiler için optimize edilmiştir, bu da de Bruin ve ark.24’ün bulgularına dayanarak^, doku girişini arttırmadan mikrodisseke dokularla uyumlu olmayabilir; doku örneklerinin cerrahi rezeksiyonlardan ziyade küçük biyopsiler olarak giderek daha fazla toplandığı bir çağda olumsuz bir talep. DLBCL90 testi için kullanılan RNA girişleri, hem makrodisseke edilmiş hem de disseke edilmemiş dokular için 68.5-300 ng arasında değişmiştir. Sonuçlar, makrodiseksiyonun incelenen örneklerin% 60’ında çağrı değişikliklerine neden olduğunu ve bu değişikliklerin makrodisseke edilen örneklerin RNA girişinden bağımsız olarak gözlemlendiğini göstermektedir. Bununla birlikte, düşük RNA girişi için COO olasılığı, eşiklerin GCB için 0 ila 0.1, UNC için 0.1-0.9 ve ABC çağrıları²⁰ için 0.9 >ila <0.0 olduğu COO CB / UNC olasılık çağrı eşiğini ihlal etmiştir. Başlıca DLBCL COO alt tipleri, tüm DLBCL vakalarının% 41 ve% 44'ünü oluşturan GCB ve ABC'dir; UNC ikisinin ara grubunu temsil eder ve ABC en agresif ^20,27’dir. Bu nedenle, COO’nun C örneğinin makrodiseksiyonu üzerine yaptığı değişiklik, COO alt tipinde GCB’den ABC’ye açık bir değişikliğe neden olmazken, GCB’den UNC’ye geçiş, daha agresif bir hastalığa doğru bir kayma önerebilir. Dahası, son zamanlarda yapılan çalışmalar, UNC alt tipinin sadece bir ara alt tip olmadığını ve potansiyel olarak alt tipe özgü terapötik olarak sömürülebilir niteliklere sahip olabileceğini göstermektedir²⁸. Benzer şekilde, A ve E örneklerinin makrodiseksiyonu, DHITsig çağrılarında DH negatiften DH pozitife veya tam tersi yönde belirgin değişikliklere neden olmamıştır. Bununla birlikte, makrodiseksiyon üzerine bir GCB örneğinin (örnek A) NEG’den UNCLASS’a ve bir ABC örneğinin (örnek E) makrodiseksiyon üzerine UNCLASS’tan NEG’e hareketleri biyolojik olarak uygundur, çünkü BCL2’yi içeren çift vuruşlu translokasyonların münhasıran bir GCB fenomeni olduğu bildirilmiştir¹⁹. Translokasyonlar klinik ortamlarda FISH tarafından geleneksel olarak ve her yerde tespit edilmesine rağmen, tespitleri için alternatif daha az ilgili ve zaman alıcı bir yöntem tanımlamak için artan bir ivme vardır. DLBCL90 testi, bu testin klinik tanı^29’da kullanılan FISH problarına şifreli translokasyonları tespit edebildiği bulgusuyla kullanımının gerekçesinin güçlendirildiği bu ihtiyacı karşılayan önemli bir araçtır.

Yukarıda açıklanan makrodiseksiyon protokolü, araştırmacıların normalde yaygın olarak kullanılan çalışma dahil etme kriterleri eşiklerinin altına düşecek doku örneklerinin tümör içeriğini arttırmalarını sağlayan basit bir yöntemi özetlemektedir. Bir çalışma iş akışına makrodiseksiyon dahil etmek, araştırmacıların tümör içeriğini artırarak zayıf tümör yoğun dokuları çalışma dışlamasından kurtarmalarını sağlar. Buna karşılık, bu, ortaya çıkan RNA ve DNA’nın genomik araştırma altındaki tümörü temsil ettiğine dair artan güvene izin verir. Doku diseksiyonu için daha kesin yöntemler mevcut olsa da, daha geniş, infiltratif olmayan, tabaka benzeri veya katı bir şekilde büyüyen tümörler için makrodiseksiyon muhtemelen yeterlidir. Burada sunulan sonuçlar, genomik tahlillerde tümör saflığının önemini ve bunu başarmak için güvenilir bir araç olarak makrodiseksiyonun önemini vurgulamaktadır.