Detecção de expressão receptora acoplada à proteína G em neurônios aferentes do mouse vagal usando multiplex in situ hibridização

Os corpos celulares de afferents vagais estão contidos na jugular, petrosal e nodose ganglia^1,2,3. Seus axônios viajam juntos através de vários ramos do nervo vago para os territórios craniocervical, torácico e abdominal^4,5,6,7. A partir de seus finais viscerais, os aferentes vagais podem responder a uma ampla gama de estímulos fisiológicos e nocivos^8,9,10. No entanto, a distribuição de moléculas de sinalização e receptores envolvidos no sensor de detecção vagal permanece pouco caracterizada. Isso ocorre em parte porque os gânglios vagais, apesar de seu pequeno tamanho, expressam um amplo espectro de receptores, incluindo um grande número de GPCRs^8,11,12,13. Além disso, os neurônios aferentes vagal são inerentemente heterogêneos e apresentam perfis moleculares distintos¹⁴. Para complicar a questão, a jugular, petrosal e nodose gânglios estão presos no rato, formando assim uma única massa gangliônica. Por último, em um subconjunto de animais, o gânglio de nodose é ligado ao simpático gânglio cervical superior¹⁵.

No passado, os pesquisadores recorreram à imunohistoquímica para estudar a maquiagem neuroquímica dos neurônios aferentes^{vagal 16,17,18}. Embora a imunohistoquímica usando anticorpos validados seja útil, os resultados de estudos imunohistoquímicos devem ser interpretados com cautela. Por exemplo, inúmeros esforços para identificar anticorpos específicos contra GPCRs falharam^{19,20,21,22,23,24,25}, levando os investigadores a concluir que a maioria dos anticorpos contra GPCRs não são confiáveis. Para contornar essas questões, o PCR quantitativo (qPCR) tem sido amplamente utilizado para avaliar a expressão genética na massa gangliônica do rodente vagal^26,27,28,29. No entanto, examinar a expressão genética usando qPCR ocorre ao custo de uma perda de informações espaciais. Em particular, não se pode prever quantas células ou quais tipos de células expressam um determinado gene de interesse (por exemplo, nodose vs. células jugulares). As questões recorrentes também incluem a contaminação com tecidos adjacentes e a inclusão de comprimentos variáveis do nervo vago, gânglio cervical superior e jugular durante a dissecação¹⁵. Como resultado das dificuldades acima, a controvérsia envolve a expressão e distribuição de vários GPCRs em neurônios aferentes vagal. Um exemplo particularmente intrigante diz respeito ao receptor de grelina (Ghsr). Considerando que alguns estudos encontraram expressão generalizada deste receptor em neurônios aferentes vagal^30,31,32, outros descobriram que Ghsr mRNA é quase indetectável no gânglio nodose^11,14. O mapeamento detalhado do MRNA ghsr na massa gânnica vagal é, portanto, justificado.

A hibridização in situ (ISH) também tem sido utilizada para avaliar padrões de expressão genética na massa gânnica vagal^{7,11,12,33,34,35}. Como as técnicas baseadas em RNA permanecem mais confiáveis e específicas do que as técnicas baseadas em anticorpos na maioria das circunstâncias^36,37, estudos do ISH têm se mostrado valiosos para uma melhor compreensão da codificação neuroquímica de neurônios aferentes vagais. No entanto, as técnicas tradicionais do ISH em si não são sem ressalvas. O ISH radioativo é sensível, mas gera antecedentes e permanece pesado³⁸. O ISH não radioativo é menos complicado, mas também menos sensível³⁸. Em contraste, o método RNAscope ISH recentemente desenvolvido é altamente sensível e gera um mínimo de fundo³⁹. O presente estudo aplicou o RNAscope fluorescente multiplex à detecção de GPCRs em neurônios aferentes do camundongo. Focamos no mapeamento da distribuição de Ghsr e comparamos sua distribuição com a do receptor de colecistocina (Cck1r), outro GPCR bem conhecido por ser expresso no gânglio³⁴. Por fim, os dois fatores de transcrição, homeobox emparelhado 2b (Phox2b) e proteína de dedo de zinco de domínio pr 12 (Prdm12), foram usados como marcadores seletivos para neurônios aferentes de nodose e jugular,^{respectivamente 14}. Sem visualizar Phox2b ou Prdm12, seria desafiador identificar as diferenças jugular vs. nodose com certeza. Potenciais armadilhas técnicas também são discutidas ao longo do artigo.