הקלטת פעילות רשת במעגלים נוסיקפטיים בעמוד השדרה באמצעות מערכי מיקרו-אלקטרוניקה
Summary
מתואר השימוש המשולב בטכנולוגיית מערך מיקרו-אלקטרודים ובגירוי כימי המושרה על-ידי 4-אמינו-פירידין לחקר פעילות נוציצפטיבית ברמת הרשת בקרן הגבית של חוט השדרה.
Abstract
התפקידים והקישוריות של סוגים ספציפיים של נוירונים בתוך הקרן הגבית של חוט השדרה (DH) מתוחמים בקצב מהיר כדי לספק תצוגה מפורטת יותר ויותר של המעגלים העומדים בבסיס עיבוד הכאב בעמוד השדרה. עם זאת, ההשפעות של קשרים אלה על פעילות רשת רחבה יותר ב-DH נותרות פחות מובנות מכיוון שרוב המחקרים מתמקדים בפעילות של נוירונים בודדים ומיקרו-מעגלים קטנים. לחלופין, השימוש במערכי מיקרו-אלקטרוניקה (MEAs), שיכולים לנטר את הפעילות החשמלית על פני תאים רבים, מספק רזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה של פעילות עצבית. כאן מתואר השימוש ב-MEAs עם פרוסות חוט השדרה של העכבר כדי לחקור את פעילות ה-DH המושרה על-ידי מעגלי DH מגרים כימית עם 4-אמינופירידין (4-AP). הפעילות הקצבית המתקבלת מוגבלת ל-DH השטחי, יציב לאורך זמן, נחסם על ידי טטרודוטוקסין, וניתן לחקור אותה בכיווני פרוסות שונים. יחד, הכנה זו מספקת פלטפורמה לחקור את פעילות מעגלי ה-DH ברקמות מבעלי חיים תמימים, מודלים של בעלי חיים של כאב כרוני ועכברים עם תפקוד נוסיספטיבי שהשתנה גנטית. יתר על כן, הקלטות MEA בפרוסות חוט שדרה מגורות 4-AP יכולות לשמש ככלי סינון מהיר להערכת היכולת של תרכובות אנטי-נוציפטיביות חדשניות לשבש את הפעילות בחוט השדרה DH.
Introduction
התפקידים של סוגים ספציפיים של אינטרנורונים מעכבים ומעוררים בתוך חוט השדרה DH נחשפים בקצב מהיר 1,2,3,4. יחד, אינטרנורונים מהווים יותר מ-95% מהנוירונים ב-DH ומעורבים בעיבוד חושי, כולל nociception. יתר על כן, מעגלי אינטרנורון אלה חשובים כדי לקבוע אם אותות היקפיים עולים על הנוירואקסיס כדי להגיע למוח ולתרום לתפיסת הכאב 5,6,7. עד כה, רוב המחקרים חקרו את תפקידם של נוירוני DH ברמת הניתוח של תא יחיד או שלם באמצעות שילובים של אלקטרופיזיולוגיה תוך-תאית במבחנה, תיוג נוירואנטומי וניתוח התנהגותי in vivo 1,3,8,9,10,11,12,13,14 . גישות אלה קידמו באופן משמעותי את ההבנה של תפקידן של אוכלוסיות נוירונים ספציפיות בעיבוד כאב. עם זאת, נותר פער בהבנת האופן שבו סוגי תאים ספציפיים ומעגלי מאקרו קטנים משפיעים על אוכלוסיות גדולות של תאי עצב ברמת מיקרו-מעגל כדי לעצב לאחר מכן את התפוקה של ה-DH, את התגובות ההתנהגותיות ואת חוויית הכאב.
טכנולוגיה אחת שיכולה לחקור תפקוד מאקרו-מעגלי או רב-תאי ברמה התאית היא מערך המיקרו-אלקטרוניקה (MEA)15,16. MEAs שימשו לחקר תפקוד מערכת העצבים במשך כמה עשורים17,18. במוח, הם סייעו בחקר ההתפתחות העצבית, הפלסטיות הסינפטית, הסינון הפרמקולוגי ובדיקת הרעילות17,18. הם יכולים לשמש הן ליישומי in vitro והן ליישומי in vivo, בהתאם לסוג ה- MEA. יתר על כן, הפיתוח של MEAs התפתח במהירות, עם מספרי אלקטרודות ותצורות שונות הזמינים כעת19. יתרון מרכזי של MEAs הוא היכולת שלהם להעריך בו זמנית את הפעילות החשמלית בתאי עצב רבים עם דיוק מרחבי וטמפורלי גבוה באמצעות אלקטרודות מרובות15,16. זה מספק קריאה רחבה יותר של האופן שבו נוירונים מתקשרים במעגלים וברשתות, בתנאי בקרה ובנוכחות של תרכובות המיושמות באופן מקומי.
אחד האתגרים של ההכנות ל-DH במבחנה הוא שרמות הפעילות השוטפות בדרך כלל נמוכות. כאן, אתגר זה מטופל במעגלי DH של חוט השדרה באמצעות חוסם תעלות K+ המגודר במתח, 4-aminopryidine (4-AP), כדי לעורר כימית מעגלי DH. תרופה זו שימשה בעבר לביסוס פעילות חשמלית סינכרונית קצבית ב- DH של פרוסות חוט שדרה חריפות ובתנאים in vivo חריפים 20,21,22,23,24. ניסויים אלה השתמשו במדבקה חד-תאית ובהקלטה חוץ-תאית או בהדמיית סידן כדי לאפיין פעילות המושרה על-ידי 4-AP 20,21,22,23,24,25. יחד, עבודה זו הדגימה את הדרישה של העברה סינפטית מעוררת ומעכבת וסינפסות חשמליות לפעילות קצבית המושרה על ידי 4-AP. לפיכך, תגובת 4-AP נתפסה כגישה החושפת מעגלי DH פוליסינפטיים מקומיים בעלי רלוונטיות ביולוגית ולא כאפיפנומנון המושרה על ידי תרופה. יתר על כן, פעילות המושרה על ידי 4-AP מציגה פרופיל תגובה דומה לתרופות משככי כאבים ואנטי-אפילפטיות כמצבי כאב נוירופתיים ומשמשת להצעת מטרות חדשות של תרופות משככי כאבים המבוססות על עמוד השדרה כגון קונקסינים 20,21,22.
כאן מתוארת הכנה המשלבת MEAs והפעלה כימית של DH עמוד השדרה עם 4-AP כדי לחקור את המעגלים הנוסיקפטיים האלה במקרו-מעגל, או ברמת האנליזה של הרשת. גישה זו מספקת פלטפורמה יציבה וניתנת לשחזור לחקר מעגלים נוסיקפטיים במצבים ‘דמויי כאב’ נאיביים ונוירופתיים. הכנה זו ישימה בקלות גם לבדיקת הפעולה ברמת המעגל של משככי כאבים ידועים ולסינון משככי כאבים חדשניים בחוט השדרה ההיפראקטיבי.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות החשיבות של DH עמוד השדרה באיתות, עיבוד, והתגובות ההתנהגותיות והרגשיות הנובעות מכך המאפיינות כאב, המעגלים בתוך אזור זה נותרים לא מובנים היטב. אתגר מרכזי בחקירת סוגיה זו היה מגוון אוכלוסיות הנוירונים המרכיבות את המעגלים האלה 6,31,32. ההת?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (NHMRC) של אוסטרליה (מענקים 631000, 1043933, 1144638 1184974 ו- B.A.G. ו- R.J.C.) ומכון המחקר הרפואי האנטר (מענק ל- B.A.G. ו- R.J.C.).
Materials
| 4-aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875-5G | |
| 100% ethanol | Thermo Fisher | AJA214-2.5LPL | |
| CaCl2 1M | Banksia Scientific | 0430/1L | |
| Carbonox (Carbogen – 95% O2, 5% CO2) | Coregas | 219122 | |
| Curved long handle spring scissors | Fine Science Tools | 15015-11 | |
| Custom made air interface incubation chamber | |||
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher | 10091130 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Glucose | Thermo Fisher | AJA783-500G | |
| Horse serum | Thermo Fisher | 16050130 | |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert10 | |
| KCl | Thermo Fisher | AJA383-500G | |
| Ketamine | Ceva | KETALAB04 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14007-14 | |
| Loctite 454 Instant Adhesive | Bolts and Industrial Supplies | L4543G | |
| MATLAB | MathWorks | R2018b | |
| MEAs, 3-Dimensional | Multichannel Systems | 60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in an 8×8 square grid. Electrodes are 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) or 50 µm (200/12/50) high and equidistantly spaced 100 µm (100/12/40) or 200 µm (200/12/50) apart. |
| MEA headstage | Multichannel Systems | MEA2100-HS60 | |
| MEA interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot | |
| MEA net | Multichannel Systems | ALA HSG-MEA-5BD | |
| MEA perfusion system | Multichannel Systems | PPS2 | |
| MEAs, Planar | Multichannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in either a 8×8 square grid (200/30) or a 6×10 rectangular grid (500/30). Electrodes are 30 µm in diameter and equidistantly spaced 200 µm (200/30) or 500 µm (500/30) apart. |
| MgCl2 | Thermo Fisher | AJA296-500G | |
| Microscope camera | Motic | Moticam X Wi-Fi | |
| Multi Channel Analyser software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| Multi Channel Experimenter software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| NaCl | Thermo Fisher | AJA465-500G | |
| NaHCO3 | Thermo Fisher | AJA475-500G | |
| NaH2PO4 | Thermo Fisher | ACR207805000 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Small spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Sucrose | Thermo Fisher | AJA530-500G | |
| Superglue | cyanoacrylate adhesive | ||
| Tetrodotoxin | Abcam | AB120055 | |
| Vibration isolation table | Newport | VH3048W-OPT | |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 S |
Referenzen
- Smith, K. M., et al. Calretinin positive neurons form an excitatory amplifier network in the spinal cord dorsal horn. eLife. 8, 49190 (2019).
- Smith, K. M., et al. Functional heterogeneity of calretinin-expressing neurons in the mouse superficial dorsal horn: implications for spinal pain processing. The Journal of physiology. 593 (19), 4319-4339 (2015).
- Boyle, K. A., et al. Defining a spinal microcircuit that gates myelinated afferent input: Implications for tactile allodynia. Cell Reports. 28 (2), 526-540 (2019).
- Browne, T. J., et al. Transgenic cross-referencing of inhibitory and excitatory interneuron populations to dissect neuronal heterogeneity in the dorsal horn. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 32 (2020).
- Graham, B. A., Hughes, D. I. Rewards, perils and pitfalls of untangling spinal pain circuits. Current Opinion in Physiology. 11, 35-41 (2019).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
- Hughes, D. I., Todd, A. J. Central nervous system targets: inhibitory interneurons in the spinal cord. Neurotherapeutics. 17 (3), 874-885 (2020).
- Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
- Hachisuka, J., Chiang, M. C., Ross, S. E. Itch and neuropathis itch. Pain. 159 (3), 603 (2018).
- Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
- Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
- Cheng, L., et al. Identification of spinal circuits involved in touch-evoked dynamic mechanical pain. Nature neuroscience. 20 (6), 804-814 (2017).
- Peirs, C., et al. Mechanical allodynia circuitry in the dorsal horn is defined by the nature of the injury. Neuron. 109 (1), 73-90 (2021).
- Huang, J., et al. Circuit dissection of the role of somatostatin in itch and pain. Nature Neuroscience. 21 (5), 707-716 (2018).
- Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2015).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Johnstone, A. F., et al. Microelectrode arrays: a physiologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century. Neurotoxicology. 31 (4), 331-350 (2010).
- Stett, A., et al. Biological application of microelectrode arrays in drug discovery and basic research. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 377 (3), 486-495 (2003).
- Xu, L., et al. Trends and recent development of the microelectrode arrays (MEAs). Biosensors and Bioelectronics. 175 (1), 112854 (2020).
- Chapman, R. J., Cilia La Corte, P. F., Asghar, A. U. R., King, A. E. Network-based activity induced by 4-aminopyridine in rat dorsal horn in vitro is mediated by both chemical and electrical synapses. The Journal of Physiology. 587, 2499-2510 (2009).
- Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Epileptiform activity in rat spinal dorsal horn in vitro has common features with neuropathic pain. Pain. 105 (1-2), 327-338 (2003).
- Kay, C. W., Ursu, D., Sher, E., King, A. E. The role of Cx36 and Cx43 in 4-aminopyridine-induced rhythmic activity in the spinal nociceptive dorsal horn: an electrophysiological study in vitro. Physiological Reports. 4 (14), 12852 (2016).
- Jankowska, E., Lundberg, A., Rudomin, P., Sykova, E. Effects of 4-aminopyridine on synaptic transmission in the cat spinal cord. Brain Research. 240 (1), 117-129 (1982).
- Semba, K., Geller, H. M., Egger, M. D. 4-Aminopyridine induces expansion of cutaneous receptive fields of dorsal horn cells. Brain Research. 343 (2), 398-402 (1985).
- Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Long-range oscillatory Ca2+ waves in rat spinal dorsal horn. European Journal of Neuroscience. 22 (8), 1967-1976 (2005).
- Egert, U., et al. A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays. Brain Research Protocols. 2 (4), 229-242 (1998).
- Thiebaud, P., De Rooij, N., Koudelka-Hep, M., Stoppini, L. Microelectrode arrays for electrophysiological monitoring of hippocampal organotypic slice cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 44 (11), 1159-1163 (1997).
- Rey, H. G., Pedreira, C., Quiroga, R. Q. Past, present and future of spike sorting techniques. Brain Research Bulletin. 119, 106-117 (2015).
- Satuvuori, E., et al. Measures of spike train synchrony for data with multiple time scales. Journal of Neuroscience Methods. 287, 25-38 (2017).
- Mendis, G. D. C., Morrisroe, E., Reid, C. A., Halgamuge, S. K., Petrou, S. Use of local field potentials of dissociated cultures grown on multi-electrode arrays for pharmacological assays. 38th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 952-956 (2016).
- Hughes, D. I., et al. Morphological, neurochemical and electrophysiological features of parvalbumin-expressing cells: a likely source of axo-axonic inputs in the mouse spinal dorsal horn. The Journal of Physiology. 590 (16), 3927-3951 (2012).
- Peirs, C., Seal, R. P. Neural circuits for pain: recent advances and current views. Science. 354 (6312), 578-584 (2016).
- Li, J., Baccei, M. L. Developmental regulation of membrane excitability in rat spinal lamina I projection neurons. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2604-2614 (2012).
- Li, J., Baccei, M. L. Pacemaker neurons within newborn spinal pain circuits. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9010-9022 (2011).
- Sandkühler, J., Eblen-Zajjur, A. Identification and characterization of rhythmic nociceptive and non-nociceptive spinal dorsal horn neurons in the rat. Neurowissenschaften. 61 (4), 991-1006 (1994).
- Lucas-Romero, J., Rivera-Arconada, I., Roza, C., Lopez-Garcia, J. A. Origin and classification of spontaneous discharges in mouse superficial dorsal horn neurons. Scientific Reports. 8 (1), 9735-9735 (2018).
- Antonio, L., et al. L. al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 33-44 (2016).
- Avoli, M., Jefferys, J. G. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
- Taccola, G., Nistri, A. Low micromolar concentrations of 4-aminopyridine facilitate fictive locomotion expressed by the rat spinal cord in vitro. Neurowissenschaften. 126 (2), 511-520 (2004).
- Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. Journal of Neurophysiology. 107 (2), 728-741 (2012).
- Egert, U., Heck, D., Aertsen, A. Two-dimensional monitoring of spiking networks in acute brain slices. Experimental Brain Research. 142 (2), 268-274 (2002).
