Spinal Nosiseptif Devrelerde Ağ Aktivitesini Mikroelektrot Dizileri Kullanarak Kaydetme
Summary
Omurilik dorsal boynuzunda ağ düzeyinde nosiseptif aktiviteyi araştırmak için mikroelektrot dizisi teknolojisinin ve 4-aminopiridin kaynaklı kimyasal stimülasyonun kombine kullanımı özetlenmiştir.
Abstract
Omurilik dorsal boynuzundaki (DH) spesifik nöron tiplerinin rolleri ve bağlanabilirliği, spinal ağrı işlemeyi destekleyen devrelerin giderek daha ayrıntılı bir görünümünü sağlamak için hızlı bir şekilde tanımlanmaktadır. Bununla birlikte, bu bağlantıların DH’deki daha geniş ağ aktivitesi için etkileri daha az anlaşılmıştır, çünkü çoğu çalışma tek nöronların ve küçük mikro devrelerin aktivitesine odaklanmaktadır. Alternatif olarak, birçok hücredeki elektriksel aktiviteyi izleyebilen mikroelektrot dizilerinin (MEA’lar) kullanılması, nöral aktivitenin yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğünü sağlar. Burada, 4-aminopiridin (4-AP) ile kimyasal olarak uyarılan DH devrelerinin indüklediği DH aktivitesini incelemek için fare omurilik dilimleri ile MEA’ların kullanımı açıklanmaktadır. Ortaya çıkan ritmik aktivite, zamanla stabil, tetrodotoksin tarafından bloke edilen yüzeysel DH ile sınırlıdır ve farklı dilim oryantasyonlarında araştırılabilir. Birlikte, bu preparat, naif hayvanlardan, kronik ağrının hayvan modellerinden ve genetik olarak değiştirilmiş nosiseptif fonksiyona sahip farelerden dokudaki DH devre aktivitesini araştırmak için bir platform sağlar. Ayrıca, 4-AP ile uyarılmış omurilik dilimlerindeki MEA kayıtları, yeni antinosiseptif bileşiklerin omurilik DH’deki aktiviteyi bozma kapasitesini değerlendirmek için hızlı bir tarama aracı olarak kullanılabilir.
Introduction
Spinal kord DH içindeki spesifik inhibitör ve uyarıcı internöron tiplerinin rolleri 1,2,3,4 oranında hızlı bir şekilde ortaya çıkarılmaktadır. Birlikte, internöronlar DH’deki nöronların% 95’inden fazlasını oluşturur ve nosiseptif de dahil olmak üzere duyusal işlemede rol oynarlar. Ayrıca, bu internöron devreleri, periferik sinyallerin beyne ulaşmak için nöroaksiye yükselip yükselmediğini ve ağrı algısına katkıda bulunup bulunmadığını belirlemek için önemlidir 5,6,7. Bugüne kadar, çoğu çalışma, in vitro hücre içi elektrofizyoloji, nöroanatomik etiketleme ve in vivo davranışsal analiz 1,3,8,9,10,11,12,13,14 kombinasyonlarını kullanarak DH nöronlarının tek hücreli veya tüm organizma analiz düzeyindeki rolünü araştırmıştır. . Bu yaklaşımlar, spesifik nöron popülasyonlarının ağrı işlemedeki rolünün anlaşılmasını önemli ölçüde geliştirmiştir. Bununla birlikte, spesifik hücre tiplerinin ve küçük makro devrelerin, DH’nin çıktısını, davranışsal tepkileri ve ağrı deneyimini şekillendirmek için mikrodevre düzeyinde büyük nöron popülasyonlarını nasıl etkilediğini anlamada bir boşluk kalmaktadır.
Makro devre veya çok hücreli seviye fonksiyonunu araştırabilen bir teknoloji, mikroelektrot dizisidir (MEA)15,16. MEA’lar birkaç on yıldır sinir sistemi fonksiyonunu araştırmak için kullanılmıştır17,18. Beyinde, nöronal gelişim, sinaptik plastisite, farmakolojik tarama ve toksisite testi17,18 çalışmasını kolaylaştırmışlardır. MEA tipine bağlı olarak hem in vitro hem de in vivo uygulamalar için kullanılabilirler. Ayrıca, MEA’ların gelişimi hızla gelişti, farklı elektrot sayıları ve konfigürasyonları artık mevcut19. MEA’ların önemli bir avantajı, birçok nörondaki elektriksel aktiviteyi aynı anda çoklu elektrotlar aracılığıyla yüksek uzamsal ve zamansal doğrulukla değerlendirme kapasiteleridir15,16. Bu, nöronların devrelerde ve ağlarda, kontrol koşulları altında ve yerel olarak uygulanan bileşiklerin varlığında nasıl etkileşime girdiğine dair daha geniş bir okuma sağlar.
İn vitro DH preparatlarının bir zorluğu, devam eden aktivite seviyelerinin tipik olarak düşük olmasıdır. Burada, bu zorluk, DH devrelerini kimyasal olarak uyarmak için voltaj kapılı K + kanal blokeri, 4-aminopryidine (4-AP) kullanan omurilik DH devrelerinde ele alınmaktadır. Bu ilaç daha önce akut omurilik dilimlerinin DH’sinde ve akut in vivo koşullar altında ritmik senkron elektriksel aktivite oluşturmak için kullanılmıştır20,21,22,23,24. Bu deneyler, 4-AP ile indüklenen aktivite 20,21,22,23,24,25’i karakterize etmek için tek hücreli yama ve hücre dışı kayıt veya kalsiyum görüntüleme kullanmıştır. Birlikte, bu çalışma ritmik 4-AP kaynaklı aktivite için uyarıcı ve inhibitör sinaptik iletim ve elektriksel sinapsların gerekliliğini göstermiştir. Bu nedenle, 4-AP yanıtı, doğal polisinaptik DH devrelerini ilaca bağlı bir epifenomen olarak değil, biyolojik alaka düzeyi ile maskeleyen bir yaklaşım olarak görülmüştür. Ayrıca, 4-AP ile indüklenen aktivite, nöropatik ağrı koşulları olarak analjezik ve antiepileptik ilaçlara benzer bir yanıt profili sergiler ve konneksinler20,21,22 gibi yeni spinal bazlı analjezik ilaç hedefleri önermek için kullanılmıştır.
Burada, bu nosiseptif devreyi makro devrede veya ağ analiz düzeyinde incelemek için MEA’ları ve spinal DH’nin kimyasal aktivasyonunu 4-AP ile birleştiren bir preparat açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, naif ve nöropatik ‘ağrı benzeri’ koşullar altında nosiseptif devreleri araştırmak için kararlı ve tekrarlanabilir bir platform sağlar. Bu preparat aynı zamanda bilinen analjeziklerin devre seviyesindeki etkisini test etmek ve hiperaktif omurilikteki yeni analjezikleri taramak için de kolayca uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Spinal DH’nin nosiseptif sinyalleme, işleme ve bunun sonucunda ağrıyı karakterize eden davranışsal ve duygusal tepkilerdeki önemine rağmen, bu bölgedeki devreler tam olarak anlaşılamamıştır. Bu konunun araştırılmasında önemli bir zorluk, bu devreleri oluşturan nöron popülasyonlarının çeşitliliği olmuştur 6,31,32. Optogenetik ve kemogenetik tarafından yönetilen transgenik teknolojilerdeki son gelişm…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) (B.A.G. ve R.J.C.’ye 631000, 1043933, 1144638 ve 1184974 hibe) ve Hunter Tıbbi Araştırma Enstitüsü (B.A.G. ve R.J.C.’ye hibe) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 4-aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875-5G | |
| 100% ethanol | Thermo Fisher | AJA214-2.5LPL | |
| CaCl2 1M | Banksia Scientific | 0430/1L | |
| Carbonox (Carbogen – 95% O2, 5% CO2) | Coregas | 219122 | |
| Curved long handle spring scissors | Fine Science Tools | 15015-11 | |
| Custom made air interface incubation chamber | |||
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher | 10091130 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Glucose | Thermo Fisher | AJA783-500G | |
| Horse serum | Thermo Fisher | 16050130 | |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert10 | |
| KCl | Thermo Fisher | AJA383-500G | |
| Ketamine | Ceva | KETALAB04 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14007-14 | |
| Loctite 454 Instant Adhesive | Bolts and Industrial Supplies | L4543G | |
| MATLAB | MathWorks | R2018b | |
| MEAs, 3-Dimensional | Multichannel Systems | 60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in an 8×8 square grid. Electrodes are 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) or 50 µm (200/12/50) high and equidistantly spaced 100 µm (100/12/40) or 200 µm (200/12/50) apart. |
| MEA headstage | Multichannel Systems | MEA2100-HS60 | |
| MEA interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot | |
| MEA net | Multichannel Systems | ALA HSG-MEA-5BD | |
| MEA perfusion system | Multichannel Systems | PPS2 | |
| MEAs, Planar | Multichannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in either a 8×8 square grid (200/30) or a 6×10 rectangular grid (500/30). Electrodes are 30 µm in diameter and equidistantly spaced 200 µm (200/30) or 500 µm (500/30) apart. |
| MgCl2 | Thermo Fisher | AJA296-500G | |
| Microscope camera | Motic | Moticam X Wi-Fi | |
| Multi Channel Analyser software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| Multi Channel Experimenter software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| NaCl | Thermo Fisher | AJA465-500G | |
| NaHCO3 | Thermo Fisher | AJA475-500G | |
| NaH2PO4 | Thermo Fisher | ACR207805000 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Small spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Sucrose | Thermo Fisher | AJA530-500G | |
| Superglue | cyanoacrylate adhesive | ||
| Tetrodotoxin | Abcam | AB120055 | |
| Vibration isolation table | Newport | VH3048W-OPT | |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 S |
Referenzen
- Smith, K. M., et al. Calretinin positive neurons form an excitatory amplifier network in the spinal cord dorsal horn. eLife. 8, 49190 (2019).
- Smith, K. M., et al. Functional heterogeneity of calretinin-expressing neurons in the mouse superficial dorsal horn: implications for spinal pain processing. The Journal of physiology. 593 (19), 4319-4339 (2015).
- Boyle, K. A., et al. Defining a spinal microcircuit that gates myelinated afferent input: Implications for tactile allodynia. Cell Reports. 28 (2), 526-540 (2019).
- Browne, T. J., et al. Transgenic cross-referencing of inhibitory and excitatory interneuron populations to dissect neuronal heterogeneity in the dorsal horn. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 32 (2020).
- Graham, B. A., Hughes, D. I. Rewards, perils and pitfalls of untangling spinal pain circuits. Current Opinion in Physiology. 11, 35-41 (2019).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
- Hughes, D. I., Todd, A. J. Central nervous system targets: inhibitory interneurons in the spinal cord. Neurotherapeutics. 17 (3), 874-885 (2020).
- Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
- Hachisuka, J., Chiang, M. C., Ross, S. E. Itch and neuropathis itch. Pain. 159 (3), 603 (2018).
- Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
- Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
- Cheng, L., et al. Identification of spinal circuits involved in touch-evoked dynamic mechanical pain. Nature neuroscience. 20 (6), 804-814 (2017).
- Peirs, C., et al. Mechanical allodynia circuitry in the dorsal horn is defined by the nature of the injury. Neuron. 109 (1), 73-90 (2021).
- Huang, J., et al. Circuit dissection of the role of somatostatin in itch and pain. Nature Neuroscience. 21 (5), 707-716 (2018).
- Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2015).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Johnstone, A. F., et al. Microelectrode arrays: a physiologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century. Neurotoxicology. 31 (4), 331-350 (2010).
- Stett, A., et al. Biological application of microelectrode arrays in drug discovery and basic research. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 377 (3), 486-495 (2003).
- Xu, L., et al. Trends and recent development of the microelectrode arrays (MEAs). Biosensors and Bioelectronics. 175 (1), 112854 (2020).
- Chapman, R. J., Cilia La Corte, P. F., Asghar, A. U. R., King, A. E. Network-based activity induced by 4-aminopyridine in rat dorsal horn in vitro is mediated by both chemical and electrical synapses. The Journal of Physiology. 587, 2499-2510 (2009).
- Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Epileptiform activity in rat spinal dorsal horn in vitro has common features with neuropathic pain. Pain. 105 (1-2), 327-338 (2003).
- Kay, C. W., Ursu, D., Sher, E., King, A. E. The role of Cx36 and Cx43 in 4-aminopyridine-induced rhythmic activity in the spinal nociceptive dorsal horn: an electrophysiological study in vitro. Physiological Reports. 4 (14), 12852 (2016).
- Jankowska, E., Lundberg, A., Rudomin, P., Sykova, E. Effects of 4-aminopyridine on synaptic transmission in the cat spinal cord. Brain Research. 240 (1), 117-129 (1982).
- Semba, K., Geller, H. M., Egger, M. D. 4-Aminopyridine induces expansion of cutaneous receptive fields of dorsal horn cells. Brain Research. 343 (2), 398-402 (1985).
- Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Long-range oscillatory Ca2+ waves in rat spinal dorsal horn. European Journal of Neuroscience. 22 (8), 1967-1976 (2005).
- Egert, U., et al. A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays. Brain Research Protocols. 2 (4), 229-242 (1998).
- Thiebaud, P., De Rooij, N., Koudelka-Hep, M., Stoppini, L. Microelectrode arrays for electrophysiological monitoring of hippocampal organotypic slice cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 44 (11), 1159-1163 (1997).
- Rey, H. G., Pedreira, C., Quiroga, R. Q. Past, present and future of spike sorting techniques. Brain Research Bulletin. 119, 106-117 (2015).
- Satuvuori, E., et al. Measures of spike train synchrony for data with multiple time scales. Journal of Neuroscience Methods. 287, 25-38 (2017).
- Mendis, G. D. C., Morrisroe, E., Reid, C. A., Halgamuge, S. K., Petrou, S. Use of local field potentials of dissociated cultures grown on multi-electrode arrays for pharmacological assays. 38th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 952-956 (2016).
- Hughes, D. I., et al. Morphological, neurochemical and electrophysiological features of parvalbumin-expressing cells: a likely source of axo-axonic inputs in the mouse spinal dorsal horn. The Journal of Physiology. 590 (16), 3927-3951 (2012).
- Peirs, C., Seal, R. P. Neural circuits for pain: recent advances and current views. Science. 354 (6312), 578-584 (2016).
- Li, J., Baccei, M. L. Developmental regulation of membrane excitability in rat spinal lamina I projection neurons. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2604-2614 (2012).
- Li, J., Baccei, M. L. Pacemaker neurons within newborn spinal pain circuits. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9010-9022 (2011).
- Sandkühler, J., Eblen-Zajjur, A. Identification and characterization of rhythmic nociceptive and non-nociceptive spinal dorsal horn neurons in the rat. Neurowissenschaften. 61 (4), 991-1006 (1994).
- Lucas-Romero, J., Rivera-Arconada, I., Roza, C., Lopez-Garcia, J. A. Origin and classification of spontaneous discharges in mouse superficial dorsal horn neurons. Scientific Reports. 8 (1), 9735-9735 (2018).
- Antonio, L., et al. L. al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 33-44 (2016).
- Avoli, M., Jefferys, J. G. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
- Taccola, G., Nistri, A. Low micromolar concentrations of 4-aminopyridine facilitate fictive locomotion expressed by the rat spinal cord in vitro. Neurowissenschaften. 126 (2), 511-520 (2004).
- Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. Journal of Neurophysiology. 107 (2), 728-741 (2012).
- Egert, U., Heck, D., Aertsen, A. Two-dimensional monitoring of spiking networks in acute brain slices. Experimental Brain Research. 142 (2), 268-274 (2002).
