Mesure de la β-oxydation des acides gras dans une suspension d’hépatocytes de souris fraîchement isolés
Summary
La β-oxydation des acides gras est une voie métabolique essentielle responsable de la génération d’énergie dans de nombreux types de cellules, y compris les hépatocytes. Ici, nous décrivons une méthode pour mesurer l’oxydation β des acides gras dans des hépatocytes primaires fraîchement isolés en utilisant de l’acide palmitique marqué 14C.
Abstract
La β-oxydation des acides gras est une voie métabolique clé pour répondre aux besoins énergétiques du foie et fournir des substrats et des cofacteurs pour des processus supplémentaires, tels que la cétogenèse et la gluconéogenèse, qui sont essentiels pour maintenir l’homéostasie du glucose dans tout le corps et soutenir la fonction extra-hépatique des organes à jeun. La β-oxydation des acides gras se produit dans les mitochondries et les peroxysomes et est régulée par de multiples mécanismes, y compris l’absorption et l’activation des acides gras, les niveaux d’expression enzymatique et la disponibilité de cofacteurs tels que la coenzyme A et le NAD +. Dans les essais qui mesurent la β-oxydation des acides gras dans les homogénats hépatiques, la lyse cellulaire et l’ajout commun de niveaux supraphysiologiques de cofacteurs masquent les effets de ces mécanismes de régulation. De plus, l’intégrité des organites dans les homogénats est difficile à contrôler et peut varier considérablement d’une préparation à l’autre. La mesure de la β-oxydation des acides gras dans des hépatocytes primaires intacts surmonte les pièges ci-dessus. Ce protocole décrit une méthode de mesure de la β-oxydation des acides gras dans une suspension d’hépatocytes primaires de souris fraîchement isolés incubés avec de l’acide palmitique marqué 14C. En évitant les heures à les jours de culture, cette méthode a l’avantage de mieux préserver les niveaux d’expression des protéines et l’activité de la voie métabolique du foie d’origine, y compris l’activation de l’β-oxydation des acides gras observée dans les hépatocytes isolés de souris à jeun par rapport aux souris nourries.
Introduction
La β-oxydation des acides gras est un processus essentiel dans le métabolisme des lipides, fournissant une voie catabolique pour équilibrer la synthèse des acides gras et l’apport de l’alimentation. Ce processus génère de l’énergie pour plusieurs organes, y compris le muscle cardiaque, le cortex rénal et le foie à jeun, et utilise les acides gras obtenus à partir de l’alimentation, la lipolyse du tissu adipeux et les réserves internes de triglycérides 1,2.
L’oxydation des acides gras par la voie β-oxydation entraîne le raccourcissement séquentiel de la chaîne acylique grasse par deux carbones à la fois, libérés sous forme d’acétyl-CoA, et ce processus se produit à la fois dans les mitochondries et les peroxysomes. Alors que la plupart des acides gras ne subissent qu’une β-oxydation, certains sont oxydés à différents carbones avant d’entrer dans cette voie. Par exemple, les acides gras substitués au 3-méthyle, tels que l’acide phytanique, subissent l’élimination d’un carbone par α-oxydation dans les peroxysomes avant d’entrer dans la voie de β-oxydation. De même, certains acides gras sont d’abord convertis en acides gras dicarboxyliques par oxydation du groupe méthyle terminal (ω-oxydation) dans le réticulum endoplasmique avant d’être préférentiellement oxydés dans les peroxysomes par β-oxydation3.
Quel que soit l’organite spécifique, un acide gras doit d’abord être converti en un thioester de coenzyme A (CoA), ou acyl-CoA, pour être oxydé par la voie de β-oxydation. β-oxydation des acyl-CoA à longue chaîne dans la matrice mitochondriale nécessite la navette carnitine pour leur translocation, où la carnitine palmitoyltransférase 1 (CPT1) catalyse la conversion des acyl-CoAs en acylcarnitines et est l’enzyme limitant le taux dans ce processus4. Une fois transloqués dans la matrice mitochondriale, les acyl-CoAs sont reformés et servent de substrats à la machinerie mitochondriale β-oxydation. À jeun, l’acétyl-CoA produit par β-oxydation dans les mitochondries hépatiques est principalement canalisé vers la cétogenèse. Les peroxysomes servent de site principal pour la β-oxydation des acides gras à très longue chaîne, à chaîne ramifiée et dicarboxyliques. Les peroxysomes n’ont pas besoin de la navette carnitine pour importer des substrats d’acides gras, mais importent plutôt les acyl-CoA correspondants par l’activité des transporteurs de cassettes de liaison à l’ATP (ABC) ABCD1-35. Dans les peroxysomes, les acyl-CoAs sont ensuite oxydés par un ensemble dédié d’enzymes, distinctes de la machinerie mitochondriale d’β-oxydation des acides gras. Les mitochondries et les peroxysomes nécessitent également un apport de NAD+ et de CoA libre pour oxyder les chaînes acyles grasses. Il a été démontré que les niveaux de CoA dans le foie augmentent en réponse au jeûne, ce qui favorise l’augmentation du taux d’oxydation des acides gras qui se produit dans cet état6. De plus, l’augmentation de la dégradation du CoA dans les peroxysomes entraîne une diminution sélective de l’oxydation des acides gras peroxysomaux7. Par conséquent, le processus d’oxydation des acides gras dans la cellule est régulé par les niveaux d’expression et les activités des enzymes impliquées dans l’activation, le transport et l’oxydation des acides gras, ainsi que par les concentrations de cofacteurs et d’autres métabolites dans plusieurs compartiments subcellulaires.
Les procédures utilisant des homogénats tissulaires pour mesurer l’oxydation des acides gras détruisent l’architecture cellulaire régulant et soutenant ce processus, conduisant à une collecte de données qui ne reflètent pas avec précision le métabolisme in vivo. Alors que les techniques utilisant des hépatocytes primaires plaqués préservent ce système, la culture de cellules isolées pendant de longues périodes entraîne une perte du profil d’expression génique in vivo qui était présent dans les cellules lorsqu’elles vivaient encore chez l’animal 8,9. Le protocole suivant décrit une méthode pour isoler les hépatocytes primaires et tester leur capacité à β-oxydation des acides gras immédiatement après l’isolement et en suspension, en utilisant l’acide [1-14C]palmitique. Le dosage est basé sur la mesure de la radioactivité associée aux métabolites solubles dans l’acide (ASM) ou à des produits, comme l’acétyl-CoA, produits par la β-oxydation de l’acide [1-14C]palmitique10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pendant la perfusion hépatique, il est essentiel d’éviter l’introduction de bulles d’air, car elles bloquent les microcapillaires dans le foie, empêchant ou restreignant la circulation tampon et diminuant globalement le rendement en hépatocytes et la viabilité20,21. Des précautions, telles qu’une inspection minutieuse de la conduite d’entrée remplie de tampon avant la canulation de la CIV et éviter de soulever la conduite d’entrée du tube con…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention R35GM119528 des National Institutes of Health à Roberta Leonardi.
Materials
| (R)-(+)-Etomoxir sodium salt | Tocris Bioscience | 4539/10 | |
| [1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL | American Radiolabeled Chemicals | ARC 0172A | |
| 1 M HEPES, sterile | Corning | 25060CI | |
| 10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette | Mettler Toledo | 17008604 | |
| 1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips | |||
| 5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes | |||
| 50 mL sterile centrifuge tubes | CellTreat | 229421 | |
| 70% Perchloric acid | Fisher Scientific | A2296-1LB | |
| BSA, fatty acid-free | Fisher Scientific | BP9704100 | |
| CaCl2 dihydrate | MilliporeSigma | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | |
| EGTA | Gold Biotechnology | E-217 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200CSPP | |
| Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, Sterile | CellTreat | 229707 | |
| Gentamicin sulphate | Gold Biotechnology | G-400-25 | |
| HDPE, 6.5 mL scintillation vials | Fisher Scientific | 03-342-3 | |
| Hemocytometer | |||
| Hypodermic needles 22 G, 1.5 in | BD Biosciences | 305156 | |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| KH2PO4 | MilliporeSigma | P5655 | |
| Liberase TM Research Grade | MilliporeSigma | 5401119001 | Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin |
| M199 medium | MilliporeSigma | M5017 | |
| MgSO4 heptahydrate | MilliporeSigma | M1880 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5980 | |
| NaCl | Chem-Impex International | 30070 | |
| NaHCO3 | Acros Organics | 424270010 | |
| Palmitic acid | MilliporeSigma | P0500 | |
| Penicillin/streptomycin (100x) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cytiva Life Sciences | SH30256.01 | |
| Positive displacement pipette MR-10, 10 µL | Mettler Toledo | 17008575 | |
| Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes | Eppendorf | 5810 R | |
| Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes | Fisher Scientific | 14-956-9A | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | TriCarb 4810 TR | |
| ScintiVerse BD cocktail | Fisher Scientific | SX18-4 | |
| Shaking water bath, 30 L capacity | New Brunswick Scientific | Model G76 | |
| Sterile cell strainers, 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Thumb Dressing Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | RS-8120 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Variable-flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 138762 | |
| Water baths, 2–2.5 L capacity |
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