Выделение ядер из почек взрослой мыши для секвенирования одноядерной РНК
Summary
Здесь мы представляем протокол выделения высококачественных ядер из замороженных почек мыши, который улучшает представление типов медуллярных клеток почек и позволяет избежать артефактов экспрессии генов от ферментативной диссоциации тканей.
Abstract
Почки регулируют различные биологические процессы, такие как вода, электролит и кислотно-щелочной гомеостаз. Физиологические функции почек выполняются несколькими типами клеток, расположенных в сложной архитектуре по всей кортикомедуллярной оси органа. Последние достижения в области одноклеточной транскриптомики ускорили понимание экспрессии генов, специфичных для клеточного типа, в физиологии и заболеваниях почек. Однако протоколы диссоциации тканей на основе ферментов, которые часто используются для секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq), требуют в основном свежей (неархивированной) ткани, вводят транскрипционные стрессовые реакции и способствуют отбору обильных типов клеток коры почек, что приводит к недопредставленности клеток продолговатого мозга.
Здесь мы представляем протокол, который позволяет избежать этих проблем. Протокол основан на выделении ядер при 4 °C из замороженной почечной ткани. Ядра выделены из центральной части почки мыши, состоящей из коры, наружного продолговатого вещества и внутреннего мозгового вещества. Это уменьшает чрезмерную представленность корковых клеток, типичных для образцов цельных почек, в пользу медуллярных клеток, так что данные будут представлять всю кортикомедуллярную ось в достаточном количестве. Протокол прост, быстр и адаптируем и обеспечивает шаг к стандартизации одноядерной транскриптомики в исследованиях почек.
Introduction
Почки демонстрируют очень сложную тканевую архитектуру. Они состоят из функционально и анатомически различных сегментов вдоль кортикомедуллярной оси и опосредуют биологические функции, такие как регуляция объема внеклеточной жидкости, электролитного баланса или кислотно-щелочного гомеостаза1.
Достижения в области одноклеточной транскриптомики позволили глубоко охарактеризовать сложные ткани и ускорили понимание экспрессии генов, специфичных для сегментов и типов клеток, в физиологии, развитии и заболеваниях почек 2,3,4.
Однако протоколы диссоциации на основе ферментов, которые часто используются для секвенирования скРНК, имеют ряд недостатков и ограничений. В зависимости от протокола они генерируют транскрипционные стрессовые реакции и смещение диссоциации тканей в сторону легче диссоциирующих типов корковых клеток 5,6. Хотя протоколы с использованием холодно-активных протеаз для эмбриональных почек способны смягчить транскрипционные изменения, связанные со стрессом, они не могут преодолеть смещение диссоциации в сторону корковых клеток и могут быть нелегко адаптированы к различным типам пораженных тканей почек7. Кроме того, одноклеточные подходы нелегко совместимы с замороженными образцами тканей, что ограничивает их применение в основном неархивированными свежими тканями, что делает сбор тканей ограничивающим фактором6.
Секвенирование одноядерной РНК (snRNA-seq) может обойти эти ограничения 8,9. Здесь мы представляем протокол выделения ядер из центрального среза замороженной ткани почек взрослой мыши (рис. 1)10. Наш протокол прост и обеспечивает стандартизированный подход к получению библиотек секвенирования РНК со сбалансированным представлением различных типов клеток почек для экспериментальных моделей, которые не связаны с сильными региональными изменениями ткани. В последнем случае наш протокол также может быть выполнен с целыми почками.
Protocol
Representative Results
Discussion
Одноклеточная транскриптомика способствует пониманию экспрессии генов, специфичных для клеточного типа, в физиологии и заболеваниях почек. Здесь мы предоставили простой и воспроизводимый метод выделения высококачественных одиночных ядер из замороженной ткани почек мыши для snRNA-seq стандартизированным способом.
Для snRNA-seq крайне важно использовать высококачественные ядра в качестве входных данных для генерации библиотек и избегать деградации РНК во время обработки тканей. Таким образом, инкубация кусочков ткани в стабилизационном растворе РНК сразу после рассечения имеет важное значение для защиты и стабилизации клеточной РНК и позволяет хранить образцы при -80 ° C неограниченное время. При применении этого протокола к замороженным тканям без обработки стабилизационным раствором РНК, таким как архивный материал, требуется пробный запуск, и необходимо оценить качество РНК, поскольку мы наблюдали значительную потерю целостности РНК в замороженной ткани без предварительной инкубации в стабилизационном растворе РНК.
В целом, надлежащая обработка образцов имеет решающее значение для максимального извлечения интактных одиночных ядер. Все этапы ресуспендирования следует выполнять путем осторожного пипетирования, чтобы избежать напряжения сдвига и физического повреждения. Буферы для окончательной ресуспендирования ядер и сортировки ядер должны содержать BSA, чтобы избежать потери и агрегации ядер.
Буферные объемы в этом протоколе оптимизированы для очень маленьких образцов тканей (~ 15 мг). Крайне важно обеспечить полный лизис клеток и достаточную промывку для получения высококачественных суспензий. Более крупные тканевые блоки или целые образцы почек приведут к чрезмерным концентрациям ядер, которые приведут к слипанию и агрегации, высокому содержанию окружающей РНК и общему плохому качеству суспензии. Если обрабатываются более крупные образцы или другие ткани, настоятельно рекомендуется выполнить пробные запуски для определения оптимальных буферных объемов для минимальных уровней РНК в окружающей среде. Качество и концентрация ядер и РНК должны быть тщательно изучены, так как перегрузка приводит к общей низкой производительности.
Кроме того, большое количество клеточного мусора, вызывающее высокие уровни окружающей РНК, не связанной с отдельными ядрами, отрицательно влияет на результаты секвенирования. Осветление суспензии ядер центрифугированием через сахарозную подушку в некоторой степени смягчает эту проблему, но также может привести к смещению в представлении типа клеток путем встречного отбора по плотным маленьким ядрам, присутствующим, например, в иммунных клетках16. Если это вызывает беспокойство, градиент сахарозы следует опустить. Напротив, мы обнаружили, что проточная цитометрия, основанная на окрашивании DAPI, имеет решающее значение для уменьшения количества клеточного мусора для получения высококачественной суспензии отдельных ядер.
Выделение одиночных ядер имеет значительные преимущества по сравнению с одноклеточными подходами8. Он совместим с правильно замороженной тканью, что делает сбор тканей более гибким и устраняет необходимость диссоциации тканей на основе ферментов, что может привести к транскрипционным стрессовым реакциям 6,17. Кроме того, он преодолевает смещение диссоциации, которое благоприятствует отбору легко диссоциируемых типов клеток почечной коры, что может привести к недопредставленности типов медуллярных клеток в некоторых подходах, основанных на ферментах 5,6,10.
Использование центрального фрагмента почки вместо цельной почечной ткани дополнительно экономит ресурсы и корректирует чрезмерную представленность обильных типов клеток, как описано ранее10. Однако, в зависимости от модели мыши или исследуемого фенотипа, может быть полезно использовать целые образцы почек вместо одного среднего среза. Образцы целых почек могут быть более репрезентативными для истинных пропорций клеток или изменений, происходящих во всей почке, тогда как обрезанный средний срез оказался выгодным для медуллярных фенотипов или когда материал образца был ограничен. Таким образом, это решение в значительной степени зависит от пользователя и должно быть тщательно продумано.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Платформу научной геномики в Центре молекулярной медицины им. Макса Дельбрюка в Ассоциации им. Гельмгольца в Берлине за техническую поддержку.
JL и KMSO были поддержаны исследовательской учебной группой GRK 2318 Немецкого научно-исследовательского общества (DFG) и исследовательским подразделением FOR 2841. KMSO был поддержан совместным исследовательским грантом 1365. AB был поддержан финансированием премии Готфрида Вильгельма Лейбница DFG, присужденной NR.
Materials
| Cell sorter | – | – | For fluorescence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter. |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000015 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | Needs to contain DAPI light cube to count nuclei. Alternatively, nuclei can be counted manually under fluorescence microscope. |
| 4′,6-Diamidino-2-phenyl-indol-dihydrochlorid (DAPI) | Biotrend | 40043/b | Stock solution prepared with a concentration of 100 µM. Used for nuclei staining in a final concentration of 2 µM. |
| D(+)-Sucrose ≥99.9%, ultrapure DNAse-, RNAse-free | VWR | 0335-500G | |
| DNA LoBind Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22431021 | |
| Ethanol, 70 % | – | – | |
| FACS tubes | pluriSelect | 43-10100-46 | |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma-Aldrich | D8938-1SET | |
| Minisart Syringe Filters 0.2 µm | Sartorius | 16534-GUK | |
| Nuclease-free Water | Invitrogen | AM9937 | |
| Nuclei EZ Prep Nuclei Isolation Kit | Sigma-Aldrich | NUC-101 | Nuclei EZ Lysis Buffer (Product No. N3408) needed for buffer preparation. |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline) 1X without calcium or magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Petri dishes, polystyrene 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| pluriStrainer Mini 100 µm | pluriSelect | 43-10100-46 | |
| pluriStrainer Mini 20 µm | pluriSelect | 43-10020-40 | |
| pluriStrainer Mini 40 µm | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| Polystyrene Centrifuge Tube (15 mL) | Falcon | 352099 | |
| Razor blades | – | – | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | EO0384 | |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | Follow manufacturer's instructions (https://international.neb.com/products/s1402-ribonucleoside-vanadyl-complex#Product%20Information). Upon use the 200 mM stock solution is reconstituted to a green-black clear solution by incubating at 65 °C. |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | |
| RNase AWAY | Fisher Scientific | 11952385 |
Referenzen
- Thomas, R. S. Kidney modeling and systems physiology. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 1 (2), 172-190 (2009).
- Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
- Park, J., Liu, C. L., Kim, J., Susztak, K. Understanding the kidney one cell at a time. Kidney International. 96 (4), 862-870 (2019).
- Clark, A. R., Greka, A. The power of one: advances in single-cell genomics in the kidney. Nature Reviews Nephrology. 16 (2), 73-74 (2020).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Muto, Y., et al. Single cell transcriptional and chromatin accessibility profiling redefine cellular heterogeneity in the adult human kidney. Nature Communications. 12 (1), 2190 (2021).
- Hinze, C., et al. Kidney single-cell transcriptomes predict spatial corticomedullary gene expression and tissue osmolality gradients. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (2), 291 (2021).
- Berger, S. L. Isolation of cytoplasmic RNA: ribonucleoside-vanadyl complexes. Methods in Enzymology. 152, 227-234 (1987).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Park, J., et al. Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease. Science. 360 (6390), 758-763 (2018).
- Kirita, Y., Wu, H., Uchimura, K., Wilson, P. C., Humphreys, B. D. Cell profiling of mouse acute kidney injury reveals conserved cellular responses to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15874-15883 (2020).
- Schneeberger, S., et al. The neuroinflammatory interleukin-12 signaling pathway drives Alzheimer’s disease-like pathology by perturbing oligodendrocyte survival and neuronal homeostasis. bioRxiv. , 441313 (2021).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
